基于纸基微流控芯片的纳米生物催化系统应用于全血分析

发布时间：2020-06-18 23:54

【摘要】：随着社会经济的快速发展,人们对生存环境和人体健康日益关注。即时检测(point-of-care testing,POCT)作为一种低成本、高效准确以及便携性强的分析设备,在医疗诊断、环境监测以及食品安全监测等领域得到了广泛的重视。自从微流控芯片被发现,它一直是人们最欢迎的POCT平台。微流控芯片是微型全分析系统中的重要技术,被称为“建立在芯片上的实验室”。它具有独立的分析系统可以在微型设备上的微型范围内进行实验室各项操作。其中,纸基微流控芯片(microfluidic paper-based analytical devices,μPAD)是微流控芯片中的最新发展领域。它以亲水性滤纸为基底,利用光刻、石蜡打印以及喷墨打印等技术制作而成,还可以结合比色、电化学、荧光以及化学发光等检测技术实现多种分析物的同时检测。天然酶是化学反应中的生物催化剂,具有高催化效率,高选择性和底物特异性强等优点。然而,大部分天然酶在强酸、强碱、高温等条件下稳定性差,酶分子结构容易降解,导致失活。酶固定化已被证明是一种在恶劣条件下能保持酶的催化活性和增强酶稳定性的有效方法。Zare课题组首次报道了以Cu3(PO4)2·3H2O为无机组分,牛血清白蛋白(BSA)为有机组分,在室温下通过一步共沉淀法合成了BSA-Cu3(PO4)2杂化纳米花。与传统两步酶固定化方法相比,这种自组装法将固定化载体的合成与酶的固定化简化成一步,实现了各种酶的纳米级固定化。该方法制备的固定化酶具备纳米材料的纳米级结构以及高比表面积,有利于在催化反应中酶和底物的接触、减少传质限制,保持了酶的催化活性以及提高了稳定性和耐久性。自组装法还可以实现双酶同时固定,固定的多种天然酶之间具有良好的生物相容,是一种良好的纳米生物催化剂可用于开发高效准确、快速简便的纳米生物催化系统应用于POCT。本课题我们构建了一个基于μPAD结合酶-无机杂化纳米花的纳米生物催化系统,应用于全血中多生物标志物的分析。本课题第一章介绍了酶固定化的物理吸附法、共价结合法以及自组装法。并详细介绍了酶-无机杂化纳米花的合成方法、优势、种类、形成机理和应用。接着,介绍了μPAD的优点、制作方法、检测技术以及应用。最后,扼要论述了本论文的研究意义和研究内容。本课题第二章报道了利用葡萄糖氧化酶(GOx)和辣根过氧化物酶(HRP)为有机组分,Cu3(PO4)2·3H2O为无机组分,在室温下通过共沉淀法制备具有高催化活性、高选择性、较好单分散性的GOxHRP-Cu3(PO4)2杂化纳米花。并利用扫描电子显微镜(SEM)、X射线粉末衍射(XRD)、能谱分析(EDX)对GOxHRP-Cu3(PO4)2杂化纳米花的形貌、组成、结构以及对形成过程进行了探讨。接着,设计了一个基于μPAD结合GOxHRP-Cu3(PO4)2杂化纳米花的纳米生物催化系统运用于对全血中葡萄糖的定量分析。在最佳条件下,我们设计的生物传感器对葡萄糖的检测下限达到了25μmol·L-1,耗时短,灵敏性高。由于上述(第二章)纸基纳米生物催化系统只实现了对单一物质进行分析,在实际生活中无法广泛推广。特别是在一些发展中国家和一些资源贫乏、医疗设备缺失的地区,他们更需要多元化POCT分析设备。而μPAD易于折叠形成分枝或设计多通路微通道,十分有利于开发多元化的POCT分析设备。在第三章我们开发了一个基于μPAD结合双酶-无机杂化纳米花的多元化POCT分析装置。该分析装置利用比色法检测技术,可以实现同时灵敏检测全血中的葡萄糖和尿酸的浓度。在这里,我们首次合成了以尿酸酶(UAO)和HRP为有机成分,Cu3(PO4)2·3H2O为无机成分的UAOHRP-Cu3(PO4)2杂化纳米花。并对它的形貌、组成、合成时间、性能以及形成机理进行了探讨。接着,在最佳合成条件下,我们提前制备好GOxHRP-Cu3(PO4)2杂化纳米花、UAOHRP-Cu3(PO4)2杂化纳米花悬浮液,避光放置在4℃备用。并利用简便的石蜡打印机将设计好的μPAD图案打印在滤纸上,热处理使固体石蜡完全熔化渗透进滤纸中形成疏水屏障,从而得到具有亲疏水通道的μPAD。接着,将提前制备好的杂化纳米花和各自的显色指示剂混合在一起,分别滴加到对应的检测区域,干燥后备用。最后,在中心区滴加一定量的全血溶液,样品通过毛细管作用自发地从中心区分布到检测区域发生显色反应。反应10分钟后,利用相机记录颜色信号变化。将图片转换成灰度值,利用图片处理软件image J分析颜色强度和梯度,将颜色信号数字化。从而实现全血样品中葡萄糖和尿酸的同时快速和定量分析。
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O643.36;R446.1
【图文】：

纳米,α-乳清蛋白,漆酶,脂肪酶

硕士学位论文酶相比，它表现出增强的酶活性和稳定性。Zare 等人通过自组装法将固定化载体的合成与酶的固定化简化成一步，从而实现了各种酶的纳米级固定化。该方法固定化酶具有纳米材料的纳米级结构以及高比表面积，有利于在酶催化反应中减少酶和和底物的传质限制，保持了酶的催化活性以及增强了酶的稳定性，是一种不同于传统的“纳米酶”的纳米生物催化剂。1.2 酶-无机杂化纳米花如图 1.1 所示，Zare 课题组[11]利用 α-乳清蛋白酶、漆酶、碳酸酐酶、脂肪酶等几种酶为蛋白质组分，Cu3(PO4)2·3H2O、为无机组分，通过自组装的方法合成了几种酶-无机杂化纳米花。研究表明，与游离酶和传统固定化酶相比较，酶-无机杂化纳米花不仅保持了酶的催化活性还提高了耐久性和稳定性。他们利用漆酶-无机

纳米,步骤,凝胶复合物,α-淀粉酶

图 1.4 （A）不活跃的 α-淀粉酶中的变构位点与 Ca2+结合生成具有活性 α-淀粉酶；（B，Cα-淀粉酶固定在较薄或较厚的 CaHPO4纳米晶体中，随 CaHPO4纳米晶体厚度的增加，嵌入淀粉酶分子与暴露分子的比例增加Wang 等人[32]也提出了一种利用 Ca2+的杂化纳米花，这种制备方法不同以往共沉淀法，但形成机理相似。首先利用壳聚糖（CS）与三聚磷酸酯(TPP)离子键法制得 CS-TPP 凝胶复合物。接着 Ca2+与 TPP 形成 Ca2P2O7晶体，最后与 CS-T凝胶复合物反应得到杂化纳米花（如图 1.5）。已制备好的杂化纳米花由 23.0 %

【参考文献】