逆转录重组酶介导等温核酸扩增技术在呼吸道合胞病毒检测中的应用

发布时间：2020-06-19 18:55

【摘要】：目的:在全球范围内,呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是一种引起婴幼儿下呼吸道感染常见的病毒病原体,给社会造成了巨大的医疗和经济负担。重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase Aided Amplification,RAA)是具有我国自主知识产权的等温核酸快速检测技术。RAA扩增产物的检测可分为荧光法和侧流层析试纸条法(Lateral Flow Dipstick,LFD)。本研究旨在建立两种方法实现呼吸道合胞病毒的快速检测,一种为含有内参的双重实时荧光逆转录重组酶介导等温核酸扩增技术(IC-rtRAA),另一种是将RAA技术与LFD相结合的LFD-rtRAA技术。评价该两种检测方法的灵敏度和特异性,并分别应用于临床标本的检测,进行临床标本检测效能的评价。方法:本研究从美国国立生物技术信息中心(NCBI)中下载RSV病毒的全基因序列,并利用Vector NTI软件进行序列比对,找出其保守区(靶基因区)。1.IC-rtRAA检测方法:根据RAA引物探针设计原则,并针对比对出的保守区设计引物和探针数条,随后筛选出最优的引物探针组合。在本实验中,首先建立了单重实时荧光逆转录重组酶介导等温核酸扩增技术(Singleplex-rtRAA),随后在此基础上加入内参,建立了含有内参的双重实时荧光逆转录重组酶介导等温核酸扩增技术(IC-rtRAA)。2.LFD-rtRAA检测方法:根据RAA-LFD引物探针的设计原则,设计了适用于LFD-rtRAA法的引物探针,并进行相应的修饰,建立了LFD-rtRAA检测方法。用含有靶基因的重组质粒标准品对此两种方法进行灵敏度的评价;用其他常见呼吸道病毒进行特异性的评价;分别利用已建立好的IC-rtRAA检测方法和LFD-rtRAA检测方法与文献报道的RT-qPCR方法同时检测278份临床标本,计算Kappa值,进行检测结果一致性比较,评估该两种方法的临床检测效能。结果:1.IC-rtRAA法的分析灵敏度为5.0拷贝/反应,未与其他常见呼吸道病毒发生交叉反应,特异性良好。采用该方法检测278例临床标本,结果与RSV RT-qPCR分析结果完全一致。2.LFD-rtRAA法可检测到的最低RSV质粒浓度为10拷贝/反应,未与其他常见呼吸道病毒发生交叉反应,特异性良好。采用该方法检测278例临床标本,结果与IC-rtRAA法和RSV RT-qPCR分析结果完全一致。结论:本研究建立的两种RAA检测方法在快速检测RSV方面具有很大的应用潜力,简便快速且具有较高的灵敏度和特异性,为呼吸道合胞病毒的检测提供了新工具。IC-rtRAA检测方法中内参的引入,保证了检测结果的准确性,有利于其在临床上的应用,且内参设计中所采取的策略对基于RAA的检测技术的实际应用具有一定的参考价值。LFD-rtRAA检测方法更适用于经济欠发达地区或现场快速检测。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R511;R440
【图文】：

LFD-rtRAA法nfo探针和扩增产物的结构示意图

【参考文献】