PCT、CRP在发热中的意义及Reelin缺失抑制淋巴瘤细胞存活和迁移的研究

发布时间：2020-06-27 00:38

【摘要】：目的发热(Fever)是临床常见的症状之一。由于各种原因导致机体的体温调节中枢功能出现障碍,使人体的温度升高,并且超过正常范围,即为发热。目前临床多以病原微生物检测、影像学检查等协助明确诊断,但是上述检查方法存在诊断时间较长、诊断阳性率偏低等缺点,因此寻找简便易行的早期诊断指标在临床上具有重要意义。本研究通过回顾性分析炎性因子降钙素原(procalcitonin,PCT)、C 反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、铁蛋白(ferritin,Ferr)在发热患者血清中的表达,探讨其在鉴别感染性发热及非感染因素所致的发热中的意义,以期为临床提供较理想的早期区分发热原因的诊断指标。方法选取我科自2016.01.01～2016.12.31期间收治的住院发热患者共317例(次),符合分析条件的患者共计305例(次);以体温38℃作为判断有无发热的界限,测定患者血清中炎性指标CRP、PCT、Ferr的表达,同时测定外周血的白细胞计数,如有条件,同时完善血培养、痰培养、G/GM试验等指标,最后应用SPSS 22.0分析软件对数据进行统计学分析。具体步骤如下:(1)根据临床资料确定患者是否存在感染,并将患者分为2组(感染组VS非感染组),比较不同组别之间,CRP、PCT及Ferr的水平有无统计学差异;(2)在感染组及非感染组中,按照外周血白细胞计数的不同再将其分为4个亚组(WBC1.0×109/L、WBC 1.0～3.5×109/L、WBC3.5～10×109/L 和 WBC1O×109/L),比较各组间相关炎症指标的水平有无统计学差异;(3)分别以CRP10mg/L,PCT0.5ng/ml及Ferr336.2ng/ml为界限,绘制ROC曲线,探讨各指标对于预测感染的价值;(4)联合上述炎症指标,进行ROC曲线的绘制,评价指标联合对于感染的预测价值。本研究中所有的统计学分析均以P0.05认为具有统计学差异,上述三项指标均符合正态性分布,故选择使用独立样本t检验。结果纳入本研究的我科发热患者共计317例,去除资料及数据不完善的患者12例,最终305例纳入分析。最小年龄为14岁,最大年龄为83岁,中位年龄56岁。其中男性患者136例,女性患者169例,男女比例136:169。结果表明,在本研究的感染组中,患者的CRP、PCT及Ferr水平,均显著高于其在无感染组中的表达,且该差异具有统计学意义。在感染组及非感染组中,按照外周血白细胞计数的不同再次进行分组,结果表明,感染组中,不同白细胞亚组间CRP和Ferr存在显著性差异,其中CRP表现为在WBC10×109/L组水平最高,其水平显著高于其他3个亚组,而WBC1×109/L组CRP水平最低;而Ferr水平在WBC1×109/L组水平最高,且显著高于其他三组,而其他三组Ferr水平无显著差异。在无感染组中,不同WBC水平间CRP指标有显著差异,表现为CRP水平由WBC1×109/L时的111.35mg/L逐渐降低为WBC 3.5～10×109/L组的26.67mg/L,随后继续呈现增长趋势,在WBC1×109/L时水平最高,其次为WBC10×109/L组时;未发现PCT 和 Ferr 的显著差异。另外,以 CRP10mg/L、PCT0.5ng/ml、Ferr336.2ng/ml为界,完成ROC曲线的绘制;结果发现,在所有病例中,CRP对于预测感染的灵敏度为86.16%,特异度为26.87%,其对于感染的阳性预测值为79.75%,阴性预测值为36.73%;PCT对于感染预测的灵敏度为98.15%,特异度为19.27%,其对于感染的阳性预测值为25.48%,阴性预测值为97.37%;Ferr对于预测发生感染的灵敏度为81.58%,特异度为13.11%,其对于感染的阳性预测值为70.06%,阴性预测值为22.22%。对于WBC1×109/L的病例,CRP水平预测感染的灵敏度为87.88%,阳性预测值为90.63%;PCT水平预测感染的灵敏度为100%,阳性预测值及阴性预测值均为100%;Ferr水平预测感染的灵敏度为91.3%,阳性预测值为91.3%。联合CRP、PCT及Ferr,对于预测感染的灵敏度为91.3%,阳性预测值为91.3%。结论在感染所致的发热患者血清中,其PCT、CRP及Ferr水平均明显升高,感染组与未感染组之间的差异具有统计学意义;感染所致的患者中,不同白细胞亚组间CRP和Ferr有显著差异:CRP表现为在WBC10×109/L组水平最高,且其水平显著高于其他3个亚组,WBC1×109/L组CRP水平最低;而铁蛋白水平在WBC1×109/L组水平最高,且显著高于其他三组,其他三组间铁蛋白的水平无显著差异。在未出现感染患者中,不同WBC水平间CRP指标亦具有显著差异,表现为当WBC1×109/L时CRP水平最高,其次为WBC1O×109/L组时;未发现PCT和Ferr的显著差异。因此推断,CRP、PCT可以作为感染所致的发热患者早期比较理想的诊断指标,而联合CRP、PCT及Ferr的测定,对于早期预测感染具有较好的价值。目的 Reelin,是一种细胞外的分泌性糖蛋白,既往研究多为研究Reelin在神经系统进展中的作用,但是近来研究发现,Reelin还与肿瘤的发病密切相关,在包括食管癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌等在内的多种肿瘤组织中存在异常表达。体外及体内实验中,Reelin蛋白都可以促进肿瘤的增殖。非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL)是血液系统常见的肿瘤之一,是源于淋巴系统的一种恶性肿瘤性疾病。研究发现,myc癌基因与8号染色体易位IgH基因与部分青少年伯基特淋巴瘤患者有关[11]。在弥漫性大B细胞淋巴瘤患者中,亦有观察发现,myc易位异常明显增高,myc表达以及Bcl2易位的发生率也较高[11]。目前临床常用的治疗方法包括放疗、造血干细胞移植、化疗药物等。在本实验中,我们通过应用免疫荧光染色、定量实时PCR及Western Blotting方法,测定了 NHL组织及NHL细胞系中Reelin的表达情况。然后通过体内及体外试验,检测Reelin缺失对于NHL细胞增殖、迁移及侵袭的作用,以明确其在NHL发生和发展过程中的作用机制。方法在本研究中,我们选取NHL患者的新鲜组织样本及NHL细胞系A20作为研究对象,以正常细胞(normal cell,NC)作为正常对照。首先将A20细胞进行复苏及传代培养,通过应用免疫荧光染色、定量实时PCR及Western Blotting检测,对Reelin在A20细胞中的表达进行了分析。然后应用shRNA脂质体转染法对A20细胞进行转染,同样以正常细胞作为对照。应用Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测细胞增殖。通过Transwell法,检测细胞侵袭及细胞迁移。提取NHL组织及A20细胞中的RNA后,通过荧光定量PCR试验检测细胞周期及细胞凋亡。提取NHL组织及A20细胞总蛋白,通过Western Blooting检测对蛋白的表达进行分析。将取得的NHL肿瘤标本固定、切片后,应用HE苏木精伊红染色试剂盒进行染色,之后通过应用DAB Plus Kit完成免疫染色。对于由于细胞凋亡所引起的形态学变化的相关检测,则通过Hoechst 33258免疫荧光染色完成。应用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定经shReelin或腺苷酸环化酶(AC)抑制剂SQ22536处理过的A20细胞中cAMP的含量。另外,我们还应用裸鼠评价Reelin的致瘤能力。A20细胞分别被shReelin和NC培养及转染。两组中的稳定转染细胞系培养于G416中,并注射给5周大的BALB/c小鼠,30天后,收集肿瘤组织用以检测,通过测定肿瘤组织的平均直径来评价肿瘤的大小。最后采用Graphpad Prism方法对相关数据进行分析(所有的数据都是通过至少3个独立实验的平均值±SD表达,每个实验至少重复进行3次)。通过t检验(the Students)完成差异性检验,P0.05被认定为具有统计学意义。结果Reelin在人类非霍奇金淋巴瘤组织和细胞系中是高表达的。我们发现在肿瘤组织的细胞质和细胞核的免疫染色中,Reelin呈现阳性反应。另外,淋巴瘤组织中,Reelin的mRNA表达明显高于其在正常组织中的表现;免疫印迹分析的结果揭示,Reelin的蛋白水平在淋巴瘤组织中是升高的。总之,相对于正常组织,在淋巴瘤组织中,Reelin的表达是异常升高的。Reelin的mRNA表达在A20细胞中明显增加(1.78±0.07),而相应的正常细胞中为1.00±0.09。与mRNA表达水平一致,淋巴瘤中Reelin蛋白的表达也比其在正常细胞中的表达明显升高。免疫荧光染色显示,Reelin蛋白主要定位于细胞质中,并且其在淋巴瘤中的表达比在正常细胞中的升高。为了进一步探讨Reelin在淋巴瘤中的生物学行为,通过RNA干预,A20细胞系的Reelin表达下调。qRT-PCR结果表明,在shReelin组中,Reelin的mRNA水平明显减少了 43%。相应的,在shReelin转染的A20细胞中,Reelin的蛋白水平也明显减少。这些结果说明,稳定的Reelin沉默的A20细胞成功建成。为了更好的了解NHL中Reelin的地位,通过MTT试验,我们检测了被shReelin或NC转染后的细胞增殖的变化趋势。shReelin转染后的细胞生长曲线,比对照组明显减低(P0.01)。另外,Transwell试验结果表明,shReelin处理组中发生迁移的A20细胞(154±12)比NC组(118±9)明显减少(P0.05)。A20细胞的Reelin被敲除后,shReelin组中的侵袭能力也明显减低(P0.05)。表明Reelin显著增强了淋巴瘤的增殖、迁移和侵袭能力。为了明确Reelin下调会导致细胞增殖时通过直接调节细胞周期还是凋亡,我们应用流式细胞分析来评价转染seReelin的A20细胞周期分布和凋亡。结果表明,shReelin组中G0/G1期细胞的比例明显升高(70.9±1.95),而NC组中为60.39± 1.96。结果表明,shReelin导致细胞周期停滞于G0/G1期(P0.01)。此外,我们发现,在A20细胞中,敲除Reelin可以明显提高细胞总体凋亡率(NC组4.57±0.37,shReelin组13.80±1.1,P0.01)。与此一致的是,Hoechst 33258染色揭示了转染了 shReelin的A20中活细胞明显减少。数据表明,通过诱导细胞周期停滞和凋亡,Reelin的缺失有抗淋巴瘤作用。通过实时qRT-PCR和Western blot试验,我们观察了 Reelin在A20细胞中的调节机制。被shReelin转染的A20细胞,其中CDK5的mRNA水平明显减低(NC组,1.00±0.06,shReelin 组,0.65±0.04),IL-10 的 mRNA 水平也明显减低(NC组,1.00±0.11,shReelin 组,0.62±0.04),而 caspase-3 的 mRNA 水平则明显升高(NC 组,1.00±0.1,shReelin 组,1.37±0.12)。Western blotting 试验表明,在shReelin组和NC组中,CDK5、IL-10及caspase-3的表达水平有类似的趋势。此外,ELISA检测结果表明,在Reelin受抑制的细胞内,cAMP的水平亦明显减低(NC 组 24.19±1.045,shReelin 组,16.75±1.269,P0.05)。为了明确AC抑制物SQ22536对淋巴瘤细胞增殖的影响,我们应用RT-PCR进行检测。结果表明,应用SQ22536后,A20细胞内cAMP的水平明显减少(NC组,26.23±0.7636;shReelin 组,14.33±0.5633)。CCK-8 法检测表明,与对照组相比,在A20细胞组中,cAMP显著抑制细胞生长(P0.01)。在被SQ22536处理后的A20细胞中,Reelin、CDK5及IL-10的表达明显减少,而caspase3的表达升高。为了明确在动物模型中Reelin的致癌性作用,我们在5周大的BAL/B小鼠中分别注入shReelin细胞和shRNA-NC细胞。在接种了 shReelin细胞的小鼠中,肿瘤体积明显缩小(P0.05),而对照组小鼠的肿瘤组织在12-21天仍稳步增加。与对照组相比,Reelin组的表达水平被强烈抑制(NC组,1±0.11;shReelin组,0.61±0.07)与对照组相比,Reelin阳性细胞数在shReelin组明显减少。这些结果表明,Reelin缺失可以抑制NHL的发生。结论研究发现,Reelin在人类非霍奇金淋巴瘤组织和淋巴瘤A20细胞中是高表达的。在非霍奇金淋巴瘤肿瘤组织的细胞质和细胞核的免疫染色中,Reelin呈现阳性反应。淋巴瘤组织中,Reelin的mRNA表达明显高于其在正常组织中的表现。相对于正常组织,Reelin的蛋白水平表达及mRNA水平表达在淋巴瘤组织中都是异常升高的。敲除Reelin可以抑制淋巴瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,并且诱导凋亡,而敲除Reelin阻止细胞增殖与细胞停滞于G0/G1期密切相关。此外,在被SQ22536处理后的细胞中,Reelin、CDK5、IL-10表达减少,而caspase 3的表达明显升高,这些都与cAMP水平的降低一致,因此cAMP信号抑制因子可能将可以作为治疗NHL的一种新途径。在接种了 shReelin细胞的小鼠中,肿瘤体积明显缩小(P0.05),动物实验的结果与体外试验类似。更进一步的研究可能会更好的理解NHL的过程。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R441.3

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