膝关节骨性关节炎性别差异的蛋白质组学研究

发布时间：2020-07-04 12:31

【摘要】：背景与目的:膝关节骨性关节炎(KOA)是由于膝关节软骨变性、骨质增生而引起的一种慢性骨性关节疾患,是运动系统中常见的多发病,该病在全球的发病率和致残率极高,严重影响人类的身心健康。多数人群的流行病学调查中发现女性KOA的患病率高于男性,女性绝经后患病率更明显高于同龄男性,且其症状相对严重。本研究旨在运用iTRAQ标记和Nano-HPLC-MS/MS联用的技术分别对男性及女性KOA血清样本中差异表达的蛋白质进行分析,建立KOA男女性别差异的差异蛋白谱,为探讨KOA的发病机制、疾病的进展和临床诊治的深入研究提供依据。方法:收集2017年1月至2017年4月在广西医科大学第九附属医院骨科门诊就诊及住院的男性KOA患者31例,女性KOA患者41例,以及各自同龄对照的血清样本各30例。样本经还原、烷基化及Trypsin酶解后,采用iTRAQ标记,随后进行Nano-HPLC-MS/MS分析。经数据搜库及蛋白定量分析,筛选出男女组中的差异蛋白谱,并对差异蛋白进行GO分析、KEGG通路分析以及IPA分析等。同时采用western blot和ELISA验证具有潜在临床意义的差异蛋白。结果:KOA患者与正常对照组共鉴定到571个蛋白。以质谱结果蛋白比值1.2或0.8,且P-value0.05为差异蛋白的筛选规则。男性组中,当和其正常对照组相比较时,共有60个蛋白差异表达在KOA患者组中,其中上调的蛋白有50个,下调的有10个;而在女性组中,相比于其对照组,共有179个蛋白差异表达在KOA患者组中,其中上调的蛋白有110个,下调的有69个。另外,男性组和女性组共同拥有的差异蛋白有38个。GO分析提示男性组差异蛋白主要参与免疫反应、固有免疫应答和蛋白水解等生物学过程;女性组差异蛋白主要参与蛋白水解、受体介导的内吞作用以及补体激活等生物学过程。在亚细胞定位方面,男性及女性组差异蛋白都是主要分布于细胞外的外泌体,细胞外区域及细胞外间隙等。在分子功能分析时,发现男性组差异蛋白具有丝氨酸型内肽酶活性、钙离子结合等分子功能;女性组差异蛋白主要具有蛋白结合及丝氨酸型内肽酶活性。同时KEGG通路分析发现男性女性组差异蛋白主要参与系统性红斑狼疮,补体和凝集瀑布反应,吞噬体等通路。此外,女性组差异蛋白还参与焦点粘连,PPAR信号通路和维生素的消化和吸收等通路。经western blot验证,C9、C4B、SAA1在男性KOA中相对于其对照组表达增高;女性组KOA组中,C4B、HSP90α比对照组表达增高,而ITIH4的表达则降低。验证结果和iTRAQ的趋势一致,证明了iTRAQ结果的可靠性。此外,ELISA结果表明Ficolin-2在男性及女性KOA组血清中降低,而DEF1在KOA组血清中的水平均增高。结论:1.通过蛋白质组学技术分别筛选建立了男性和女性KOA组中的差异表达蛋白谱,这些蛋白质分子可以作为潜在的分子标志物进一步深入研究,将有助于揭示男女KOA的发病机制,为研究KOA疾病的进展和临床诊治提供理论依据。2.Ficolin-2和DEF1是男性及女性KOA潜在的诊断生物标志物。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R684.3;R446.1
【图文】：

8图 1 所示 iTRAQ 试剂的结构以及质谱鉴定的原理示意图Figure 1. The structure of the iTRAQ reagent and the principle of mass spectrometryiTRAQ 试剂由三部分组成：报告基团（reporter group），平衡基团（balancegroup），以及肽反应标记试剂基团（peptide reactive group）。其中，报告基团在四标iTRAQ试剂中的相对分子量分别为114Da，115Da，116 Da，117 Da，平衡基团相对分子量分别为 31Da，30Da，29Da，28Da，八标 iTRAQ 试剂中报告基团的相对分子质量分别为 113Da，114Da，115Da，116Da，117Da，118Da，119Da，121 Da，平衡基团的相对分子质量分别为 192Da、191Da、190Da、189Da、188Da、187Da、186Da 和 184Da。在四标 iTRAQ 试剂中，

以上实验中涉及样本的抽取均得到了患者或其家属的知情同意书，血清样本的使用已获得广西医科大学第九附属医院伦理委员会批准同意对每位参与者抽取空腹外周静脉血 4mL，室温静置 30min，4℃ 2000 g心 15min，吸取上层血清并分装，冻于-80℃冰箱待用。2.2 实验技术路线实验技术路线如图 2，主要包括以下五个部分：（1）等体积混合 K患者及对照组各 15 例血清样本；（2）利用 ProteoMiner Large-Capacity K去除血清中的高丰度蛋白；（3）蛋白酶解及 iTRAQ 标记；（4）通Nano-HPLC-MS/MS 鉴定 KOA 血清差异表达的蛋白，对差异蛋白进行生信息学分析；（5）部分差异蛋白的表达验证。

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