【摘要】：放射性肺损伤是胸部肿瘤放射治疗较为常见的并发症之一,不仅限制了放疗方案的制定和肿瘤的局部控制率,同时对患者生存质量以及存活率也产生了严重的影响。目前对于放射性肺损伤(Raiation-induced lung injury,RILI)尚缺乏有效的治疗方法。间充质干细胞(MSCs)可以归巢至受损组织,因此被广泛用作基因治疗的载体。此外,MSCs还可以通过分化为上皮细胞,分泌多种生物活性物质等来修复受损的组织。课题组之前的研究证实,MSCs可以归巢至放射损伤的肺脏,并抑制放射诱导的上皮细胞凋亡。多项研究已经表明,基因修饰可以增强间充质干细胞(MSC)的功能,已经成为治疗多种肺部疾病的有力工具。核心蛋白多糖(Decorin)是细胞外基质(ECM)中普遍存在的成分,可以与胶原蛋白结合,阻止胶原纤维的形成并破坏其组织。本研究拟探讨Decorin基因修饰的MSCs对放射性肺损伤的治疗作用及其作用机制。首先,我们制备携带Decorin基因的复制缺陷型腺病毒Ad-DCN,获得高表达Decorin的MSC,即MSCs.DCN,并分析了DCN高表达对MSCs细胞生物学特性的影响。分离得到的脐带MSCs(UC-MSCs)培养在含10%胎牛血清的α-MEM培养基,在37℃,5%CO2的细胞培养箱中培养,扩增至2-4代。用150MOI Ad-DCN或Ad-Null感染UC-MSCs,感染后48h,通过流式细胞术分析其免疫表型;用APC结合的Annexin-V和PI标记细胞,并通过流式细胞术分析细胞凋亡;用染料dye670标记MSC,第二天用Ad-DCN或Ad-Null感染细胞,然后在感染后的不同时间,通过流式细胞术测量荧光强度并计算增殖率;MSCs感染腺病毒Ad-DCN或Ad-Null后24h和48h,提取总RNA,采用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测Decorin基因及其靶基因表达情况。实验结果提示:制备的Ad.DCN符合下一步实验要求;高表达Decorin基因对MSCs细胞的表型和凋亡没有明显影响,对MSC细胞的增殖也没有明显影响,只是在感染后72h检测到轻微的增殖抑制。其次,我们建立了放射性肺损伤的动物模型并制定了治疗方案。将86只C57BL/c小鼠进行胸部局部Co60γ射线照射,剂量为20Gy。另外20只未照射小鼠作为正常对照组。将模型小鼠随机分为5组:即照射组(照射后6h尾静脉注射PBS,20只),MSCs.DCN PR 6h组(照射后6h尾静脉注射MSCs.DCN,20只),MSCs.Null PR 6h组(照射后6h尾静脉注射MSCs.Null,20只),MSCs.DCN PR 28d组(照射后28d尾静脉注射MSCs.DCN,13只)和MSCs.Null PR 28d组(照射后28d尾静脉注射MSCs.Null,13只)。在MSCs.DCN PR 6h(或MSCs.Null PR 6h)和MSCs.DCN PR 28d(或MSCs.Null PR 28d)组中,通过静脉注射相应的基因修饰的MSC(1×106细胞/100μl PBS)。接着,我们对模型小鼠肺组织进行病理学分析。照射后28d和3个月,每组10只小鼠安乐死,取出肺组织。组织用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,切成5μm厚的切片。HE染色观察肺泡壁厚度,肺泡腔内炎性浸润,肺泡充血,出血等病理组织学改变。此外,Masson染色检测胶原沉积,并在数字成像显微镜下观察。照射后28d,对照组,照射组,MSCs.DCN PR 6h组和MSCs.Null PR 6h组的肺组织按上述方法处理。分别用末端脱氧核苷酸转移的UTP缺口末端标记(TUNEL)和Ki67染色检查组织切片中的细胞凋亡和增殖。随机选取5个视野(400×)计数阳性染色的肺泡上皮细胞,并计算凋亡率和增殖指数。实验表明,局部接受单次20Gyγ射线照射后,急性期可见明显的组织病理损伤,如炎细胞浸润,肺泡壁破裂,肺泡间隔增厚,诱发肺泡上皮细胞凋亡。而γ射线照射也可在放疗后3个月时引起肺纤维化。在急性炎症阶段,MSCs.DCN和MSCs.Null均能保护肺的结构,减轻炎症浸润,抑制放射诱导的上皮细胞凋亡,促进上皮细胞增殖。更重要的是,MSCs.DCN对放射引起的肺损伤具有更强的保护作用。在治疗3个月后,Masson染色检测肺泡,支气管,血管胶原沉积。结果表明,两组MSCs均能促进组织修复,有效保护肺脏结构,抑制纤维化。放射后较早期治疗(放疗后6h)在保护肺脏结构和抑制受损肺脏纤维化方面更为有效。而且,MSCs.DCN组对胶原沉积的抑制作用强于MSCs.Null组。最后,我们分析了MSCs.DCN介导的干预作用的可能机制。(1)检测外周血中趋化因子和炎性细胞因子的表达:在照射后3d,7d,14d,28d和3m时,收集外周血样品,制备血清。通过小鼠Th1/Th2和趋化因子组多因子检测试剂盒来检测外周血中IFN-γ、Eotaxin、RANTES、MCP-1、MCP-3、MIP-1α、MIP-2和IP-10的表达情况。(2)肺组织局部炎性细胞因子和纤维化相关因子的表达:照射后28d和3m,收集小鼠肺组织,每组4只小鼠。提取总RNA,通过实时定量RT-PCR法检测Decorin及其靶基因TGF-β和VEGFA,以及IL-10、IL-12、ICAM、TNF-α、IFN-γ、col1α1和col3α1等在m RNA水平的表达情况。(3)模型小鼠淋巴细胞免疫表型分析:照射后28d,采集外周血标本。用APC-CD3e,PE-CD4和FITC-CD8a标记血细胞,流式细胞术分析T淋巴细胞CD4+或CD8+细胞百分比。在照射后3d,7d,14d和28d,收集模型鼠外周血,用FITC-CD4,APC-CD25和PE-Fox P3标记细胞,用流式细胞术检测CD4+T淋巴细胞中CD25+Fox P3+Tregs细胞的百分比。另外,照射后6h注射细胞组在照后28d取脾脏,制备单细胞悬液,如上所述标记细胞并通过流式细胞术分析。结果表明,MSCs治疗减少了趋化因子和炎性细胞因子的表达,增加了外周血和局部肺组织中抗炎细胞因子的表达。有趣的是,在照射后3个月的肺组织中仍然可以检测到MSCs.DCN介导的Decorin的表达,表明给予细胞治疗后MSCs可归巢并定植于受损的肺脏中。尽管MSCs.DCN和MSCs.Null均可有效下调Decorin靶基因,如转化生长因子(TGF-β)和血管内皮生长因子A(VEGFA)的表达,但MSCs.DCN在诱导IFN-?表达,抑制肺组织中Col3α1的表达,以及减少外周血中调节性T细胞(Tregs)的比例方面较MSCs.Null更为有效。此外,研究结果还表明,与照射后较晚期治疗组相比,在照射之后的急性期进行治疗,其减轻炎症和抑制纤维化方面效果更佳。综上所述,DCN基因修饰的MSCs可以减轻照射所致的肺脏急性炎症反应,并显著抑制后期纤维化形成。DCN通过靶向促纤维化因子和Treg来增强MSCs的功能。因此,我们认为MSCs.DCN是一种治疗RILI的有效策略。
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730.55
【图文】：
重组腺病毒转染 293 细胞后的镜下变ull 和 Ad.DCN 经过扩增，用 CsCl 密度梯度离心法病毒纯化示意图（箭头所指用紫外分光光度法检测 OD260nm 和 的比值来计算病毒的纯度，用 OD260
度梯度离心法病毒纯化示意图（箭头所运用紫外分光光度法检测 OD260nm m 的比值来计算病毒的纯度，用 OD2示，病毒的颗粒滴度均在 1×1011vp/mL的纯度要求。表明我们成功扩增了并纯度和颗粒滴度符合下一步实验的要表 1-3 重组腺病毒的纯度与颗粒滴度颗粒滴度（vp/mL） 纯1.21×10121.35.36×10111.3滴度，Ad.DCN 和 Ad.Null 的感染
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本文编号：2742065
