NADH对放射性肠炎的保护作用及其机制研究

发布时间：2020-07-08 12:13

【摘要】：目的验证NADH对放射治疗副作用之一的放射性肠炎是否具有保护作用,并试图对其作用机制在细胞过程及分子信号通路层面上进行探索。实验方法1.选用IEC-6系大鼠小肠粘膜细胞,以完全培养基进行培养,适时传代,待足够多的分瓶,细胞贴壁后,加入不同浓度(0,100,200,300,400,500,600,700,800ug/ml)的 NADH 处理,以细胞计数试剂盒分析细胞活力。2.将IEC-6细胞以一定浓度为2.5×105置于多孔培养板继续培养,随机分为3组,用4GyX射线处理细胞。然后各组分别加入Oug/ml,100ug/ml,200ug/mlNADH。膜联蛋白V-APC/7-AAD染色用流式细胞术测定细胞凋亡,另裂解细胞提取总蛋白,Western blot测定细胞抗凋亡蛋白BCL2促凋亡Bax蛋白含量3.对前述射线NADH处理的细胞,10μM2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFDA)测定ROS含量,再用Western blot测定炎症因子IL-1β,P65和TNFα及自噬标志蛋白LC3和Beclin1、自噬相关信号分子PI3K及磷酸化AKT的表达4.培养IEC-6细胞再分为4组,4GyX射线处理,各组分别加入Oug/ml,100ug/ml,200ug/ml NADH及 100ug/m1+3-MA 自噬抑制剂,以膜联蛋白V-APC/7-AAD染色并用流式细胞术测定细胞凋亡,Western blot测定炎症因子IL-1β,P65和TNFα及DCFDA测定活性氧类含量,PI3K及磷酸化AKT表达,。5.选用6周龄雄性C57BL小鼠16只行动物实验。随机分为4组:对照组,NADH组,RT组,RT + NADH组。每组4只。适应1周后,对RT和RT + NADH组进行致死剂量的射线照射,后对NADH和RT + NADH组给予10mg/kg/天的NADH,7天后,记录体重,处死动物,取肠组织样本,HE染色制片,免疫组化测定炎症因子及自噬相关蛋白表达情况。结果1.不同浓度(0,100,200,300,400,500,600,700,800ug/ml)的 NADH,,500ug/ml以下浓度的NADH对IEC-6细胞活力没有明显副作用,但600ug/ml以上浓度的NADH对细胞活力具有一定的抑制作用。之后的细胞实验中,NADH用量均在安全范围内,即100,200ug/ml,。2.经4Gy照射的IEC-6细胞,相比空白对照组,NADH处理组的凋亡率明显降低9.8 5.2.4.1,西部免疫印迹法亦显示NADH处理过的细胞抗凋亡蛋白BCL2表达增加,促凋亡Bax蛋白表达降低,这些差异均与加入NADH的剂量相关3.免疫荧光结果显示NADH处理过的IEC-6细胞自噬标志物LC3表达增加,胞内活性氧类含量明显降低,西部免疫印迹法噬标志物LC3表达增加,炎症因子IL-1β,P65和TNFα表达亦受抑制。NADH处理过的IEC-6细胞中,自噬下调通路的信号分子PI3K及磷酸化AKT的表达降低。NADH的剂量相关.4.在NADH处理的基础上以3-MA抑制自噬,PI3K及磷酸化AKT表达恢复,活性氧类含量增加,凋亡率增加。5.RT组体重减轻,发现NADH可显著抑制肠充血,水肿和体重减轻。炎症因子过度表达自噬受到抑制。HE表明NADH可以保护绒毛的高度。肠粘膜损伤较少。结论NADH可通过下调PI3K/AKT信号通路激活放射线照射后的细胞自噬,从而有效降低胞内ROS含量,和炎症因子的产生,抑制辐射诱导的细胞凋亡,阻滞炎症反应的发生和发展,维持细胞内外环境的相对稳定,保护肠粘膜组织细胞免受放射性肠炎引起的损伤和破坏,是有待进一步研究的放射治疗肠粘膜保护剂。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730.55
【图文】：

图２．流式细胞术结果显示，经放射线照射后，细胞用Ｏｕｇ／ｍｌ，１００ｕｇ／ｍｌ，逡逑２００ｕｇ邋／邋ｍｌ邋ＮＡＤＨ邋处理邋４８邋小时。９．８％邋５．２％邋４．１％。表明邋ＮＡＤＨ邋对丨ＥＣ－６邋细胞抗逡逑调亡作用，且作用强度与剂量相关。逡逑经多次重复实验，各组差别有统计学意义（Ｐ＝0．00ｌ＜0．0５）。据此推断ＮＡＤＨ逡逑浓度与细胞凋亡率负相关，另以Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测各组细胞抗凋亡蛋白ＢＣＬ２逡逑及促凋亡蛋白ＢＡＸ表达含量有无差异，结果显示，与ＮＣ组细胞相比，１００明／逡逑ｍｌ和２００明／邋ｍｌ组的细胞抗凋亡蛋白ＢＣＬ２的表达较多，促凋亡基因Ｂａｘ的表逡逑达较少（图３邋）。逡逑ＮＣ邋１００ｕｇ／ｍｌ邋２００ｕｇ／ｍｌ逡逑ＢＣＬ２邋ｍｍ逡逑－－冒，逡逑ＢＡＸ逡逑

洱以Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测各组细胞的炎症因子ＩＬ－丨ｐ，邋Ｐ６５和ＴＮ邋Ｆｃ（表达檇无）：：］逡逑异，结果显示，与ＮＣ组细胞相比，ｌＯＯｐｇ／ｍ丨和２０0ｎｇ／ｍｌ组的细胞炎龆逡逑ＩＬ－ｌｐ，Ｐ６５和ＴＮＦｕ表达较少（图４），经多次重复实验，各组差R%仃统丨丨学盘逡逑３９逡逑

细胞中自嗟相关蛋白ＬＣ３ＩＩ及活性氧类物质ＲＯＳ的含量有无差异，结果显示，逡逑与ＮＣ组细胞相比，１００（ｉｇ／邋ｍｌ和２００明／邋ｍｌ组的细中自噬相关蛋白ＬＣ３ＩＩ表达逡逑较多，ＲＯＳ含量较少（图５，邋６）。经多次重复实验，各组差别有统计学意义逡逑（Ｐ邋＝０．００１邋＜０．０５）。逡逑■逡逑图５－１．１００邋ｕｇ／邋ｍｌ邋ＮＡＤＨ组细胞内的活性氧类ＲＯＳ的含量逡逑４０逡逑

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 ;X-ray induced L02 cells damage rescued by new anti-oxidant NADH[J];World Journal of Gastroenterology;2003年08期

本文编号：2746524