重组PD-L1调控效应T细胞功能在小鼠aGVHD中的作用及机制研究

发布时间：2020-07-11 05:53

【摘要】：目的:探究重组PD-L1对T细胞功能的影响及其在小鼠a GVHD的作用及机制。方法:1.体外分选得到CD4~+T细胞和CD4~+CD25-细胞,将其在单一Anti-CD3、Anti-CD3~+Anti-CD28和MLR三种模式下进行培养,通过CD69、CD44、CTLA-4、Lag-3、Tim-3检测细胞活化,CFSE和Annexin V-FITC/PI进行细胞增殖及凋亡检测,行ELISA及胞内细胞因子染色检测细胞因子表达,流式细胞术检测PD-L1对Treg细胞分化的影响。探究可溶性PD-L1蛋白在不同条件下对T细胞活性、增殖、凋亡及细胞因子分泌的影响,以及其与Treg细胞之间的联系。2.采用PAS方法构建PD-L1质粒,以PCDN3.1为载体连接小鼠PD-L1基因片段。体内构建三种a GVHD模型,移植前1天,对照组受体鼠通过尾静脉注射PCDN3.1质粒,实验组注射PD-L1质粒。(1)BALB/c(H2Kd)作为受体鼠接受650c Gy全身性致死性辐照,4小时后通过尾静脉注射的方法输注1×107 C57BL/6(H2Kb)骨髓细胞和5×106全脾细胞;(2)C57BL/6(H2Kb)作为受体鼠接受800c Gy全身性致死性辐照,4小时后通过尾静脉注射的方法输注1×107 BALB/c(H2Kd)骨髓细胞和1×107全脾细胞;(3)BALB/c(H2Kd)作为受体鼠接受650c Gy全身性致死性辐照,4小时后通过尾静脉注射的方法输注1×107 C57BL/6(H2Kb)骨髓细胞和5×106去除Treg细胞的全脾细胞;观察三种模型下小鼠生存和体重变化,记录a GVHD评分。移植后第7天或第14天采用流式细胞术检测前两种模型中两组小鼠的脾脏中T细胞各亚型的变化及细胞因子的表达量。结果:1.体外Anti-CD3刺激的情况下,PD-L1抑制CD4~+T细胞的增殖、活性及细胞因子的表达,同时促进其凋亡;但是对Treg的增值和分化没有影响。在Anti-CD3和Anti-CD28培养情况下,PD-L1抑制CD4~+T细胞的增殖、活性及细胞因子的表达,促进凋亡,同时可以诱导Treg细胞的产生;2.PD-L1在IL-2及TGF-β作用下抑制Treg细胞的分化和增殖;3.过表达PD-L1可以显著减轻a GVHD症状,延长小鼠生存;4.PD-L1能够减弱移植后a GVHD小鼠靶器官的病理损伤;5.在混合淋巴细胞反应中,PD-L1抑制T细胞的增殖但不影响Treg细胞的分化和增殖;6.PD-L1抑制小鼠a GVHD是Treg细胞非依赖的,不同模型下PD-L1仍能发挥抑制a GVHD的作用;7.不同模型下,PD-L1仍能发挥抑制a GVHD的作用。结论:1.PD-L1可以直接抑制T细胞的活性、增殖及细胞因子的分泌;2.PD-L1主要通过抑制效应T细胞的表达及功能减轻小鼠a GVHD症状;3.PD-L1抑制小鼠a GVHD是通过Treg细胞非依赖的途径。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R457.7;R733
【图文】：

15图 1.在 Anti-CD3 体外培养下，加入可溶性 PD-L1 蛋白会抑制 CD4+T 细胞的、活化、细胞因子的分泌，同时促进其凋亡。A-D.两种细胞在实验组和对照组胞增殖及 Treg 比例的变化。E-F.加入 PD-L1 后对细胞凋亡的影响。G.胞内染色实验组细胞内细胞因子表达水平。H.体外培养 3 天后，流式检测细胞表面负性免控因子的表达。I-J.ELISA 检测体外细胞培养上清，比较两组之间的差别。*，P<0，0.001<P<0.01，***，P<0.001。

图 2.在 Anti-CD3 联合 Anti-CD28 体外培养下，加入可溶性 PD-L1 蛋白会抑4+T 细胞的增殖、活化、细胞因子的分泌，促进其凋亡，同时诱导 Treg 的产B.两种细胞在实验组和对照组中，细胞增殖及 Treg 比例的变化。C-D.加入 PD对细胞凋亡的影响。E.胞内染色观察比较细胞内细胞因子表达水平。F.体外培后，流式检测细胞表面负性免疫调控因子的表达。G-H.ELISA 检测体外细胞培，比较两组之间的差别。*，P<0.05，**，0.001<P<0.01，***，P<0.001。3. PD-L1 在 IL-2 及 TGF-β作用下抑制 Treg 细胞的增殖前面的研究提示 PD-L1 可能诱导 iTreg 细胞的分化和增值，为了进一步研-L1 对 Treg 细胞的影响，我们建立了体外 Treg 诱导体系，在行 Anti-CDti-CD28 包被的板子中加入低浓度的 IL-2 (50IU/ml) 和 TGF-β（2.5ng/ml），诱导 胞的产生。我们发现在体外诱导培养体系中，无论初始诱导的 CD4+T 细胞中是

图3.体外诱导 Treg 细胞产生的体系中，可溶性 PD-L1 通过抑制 Treg 细胞的增降低 Treg 细胞的表达。A.在诱导体系中，PD-L1 对 Total CD4 细胞增殖及 Treg 细的影响。B.在诱导体系中，PD-L1 对 CD4+CD25-细胞增殖及 Treg 细胞的影响。C.PD对 Treg 细胞增殖的影响。*，P<0.05，**，0.001<P<0.01，***，P<0.001。4.4. PD-L1 质粒构建及在小鼠体内的表达通过体外实验我们发现 PD-L1 在不同体系下均能抑制 T 细胞的活化、增殖及胞因子的分泌。因此，我们进一步通过体内 aGVHD 模型研究 PD-L1 对异基因反细胞的影响，及其在 aGVHD 发生发展中的作用。我们采用高压水流动力学方法注PD-L1 过表达的质粒，从而在体内过表达 PD-L1。将目的基因 PD-L1 与 PCDN3.粒重组后在 TOP10 菌株中表达，我们将产物进行酶切鉴定发现目的基因片段在 75左右与 PD-L1 基因一致（图 A）。为了了解尾静脉注射 PD-L1 质粒能否在小鼠体内

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本文编号：2750041