新型贵金属质谱芯片的制备及其体外诊断应用研究
发布时间：2020-07-11 22:20
【摘要】：体外诊断通过检测人体样本获取临床诊断信息。临床诊断信息中超过66%来自于体外诊断。与具有创伤性的手术探查及辐射性的影像学检查相比,体外诊断具有便捷性、低创伤、易操作性以及经济性等优点。代谢组学在体外诊断方面同基因组学、蛋白质组学等组学技术相比具有代谢物是生物体生理病理状态改变的最终结果,其种类及数量相对较少,且许多内源性的小分子代谢物的生化代谢途径已被证实等优点。激光解吸电离质谱代谢分析依赖于合理设计的材料、设备以进行样品预处理和代谢物检测,实现不同生物样品的诊断应用。本文研究了新型质谱芯片的制备并利用其进行了基于代谢图谱的体外诊断应用。我们首先利用溶胶提拉及磁控溅射方法制备了贵金属质谱芯片,该质谱芯片可与点样仪联用实现微量样品(500 nL)的自动化及高通量检测,并讨论了芯片制备参数如贵金属溅射时间、二氧化硅颗粒尺寸及其溶胶质量分数在激光解吸电离质谱标准代谢小分子检测方面的影响且得到了优化参数,并用于后续生物样本如血清、尿液等代谢小分子的检测;其次基于金质谱芯片对血清及外泌体代谢组质谱检测实现了早期非小细胞肺癌的诊断,诊断预测率分别达到了0.726和0.716,并筛选出可能用于临床诊断的潜在标志物;随后我们制备了银质谱芯片并用于微量大肠杆菌的检测:在银芯片的制备优化过程中将标准代谢小分子的质谱检测效果与采用有限时域差分方法模拟的电场进行了比较,得到了优化的银质谱芯片制备参数,并基于此芯片实现了10-100个微量大肠杆菌的质谱检测;最后我们利用铂质谱芯片进行了脑卒中的体外诊断研究,对控制组与脑卒中的两个亚型动脉粥样硬化血栓形成型及小动脉闭塞型的代谢物分别进行了比较,发现控制组与动脉粥样硬化血栓形成型脑卒中有较好的鉴别、预测效果。总之,本文为临床体外诊断的代谢分析材料、芯片设计打下了基础,并能以此为基础开发个性化诊断工具进行各种疾病的诊断及细菌的鉴定等。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R446;O657.63
【图文】：
- 4 -图 1-1 通过 NMR 技术实时监测癌细胞（HepG2，黑线）与正常细胞（NKNT-3，蓝线）的代谢小分子浓度变化[34]。代谢物检测浓度采用绝对浓度（pg/细胞）。Figure 1-1 Real-time flux comparison in live normal (NKNT-3) and cancer (HepG2) cells.Time-dependent metabolic changes between normal (blue) and cancer (black) cells were obtainedusing in-cell NMR metabolomics approach. The metabolite quantified in their absoluteconcentrations (picogram per cell).2. 基于色谱质谱联用的代谢物研究色谱质谱联用技术结合了色谱的高效、快速分离组分特点和质谱的物质定性鉴定和结构分析优势，具有高灵敏度和特异性高的特点[29, 50-53]。基于不同的前段色谱，色谱质谱联用技术包括气质联用（GC-MS、GC-TOF MS）、液质联用（LC-MS、
图 1-2 静脉注射前及 30 分钟后血清和脑脊液中甘露醇的浓度含量变化。每个样本均做 5次独立重复实验以计算平均值和标准差。Figure 1-2 Mannitol levels as measured in a) CSF and b) serum from three patients before and30 min after intravenous injection (p < 0.05, Wilcoxon signed-rank test). Five independentexperiments were performed for each sample to calculate the standard deviation (s.d.) as errorbars. Data were shown as the mean ±s.d. (n = 5)综上所述，通过采用合适的基质材料，激光解吸电离质谱能够准确地测定生物样品中的代谢小分子精准质荷比；同时只需对待检生物样品如血清、尿液及脑脊液等简单的预处理（如稀释）步骤或无需处理，而且检测速度快，适用于样本的高通量检测分析。因此本文采用激光解吸电离质谱方法（LDI MS）对生物样本中的代谢物小分子进行检测。1.1.3 数据处理方法
73-74]。Chen 等[26]利用 OPLS-DA 方法分别来评价训练组和盲测组中急性髓细胞样白血病（AML）与正常对照控制组（HC）的血清代谢物异同，结果发现两组间的代谢物有明显的差异，如图 1-3 所示。该研究为血清代谢物和代谢途径作为新的预后标志和潜在治疗靶点提供了有力的证据。而 S-plot 图则用于寻找区分组间差异标志物。S-plot 图中的 y 轴表示相关性（correlation），即区分两组的标志物的可靠性；x 轴表示协方差（covariance），即标志物在区分两组时的重要性。且 S-plot图中 “两翼”的相关性值协方差值最大，即区分两组的贡献值最大，相反，中心处的点贡献值很小，如图 1-4 所示[67]。通过该方法，Stolee 等[67]发现己糖（质荷比值为 203/219）和一些次生代谢产物，如蒜氨酸（质荷比值为 178）主要积累在细胞质中；与此相反，一些氨基酸（如质荷比值为 147 的谷氨酰胺和质荷比值为 175的精氨酸）则在细胞核中更容易检测到。采用该方法时要注意标志物的变异权重系数（variable importance in projection, VIP）的值要大于 1。
本文编号：2751003
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R446;O657.63
【图文】：
- 4 -图 1-1 通过 NMR 技术实时监测癌细胞（HepG2，黑线）与正常细胞（NKNT-3，蓝线）的代谢小分子浓度变化[34]。代谢物检测浓度采用绝对浓度（pg/细胞）。Figure 1-1 Real-time flux comparison in live normal (NKNT-3) and cancer (HepG2) cells.Time-dependent metabolic changes between normal (blue) and cancer (black) cells were obtainedusing in-cell NMR metabolomics approach. The metabolite quantified in their absoluteconcentrations (picogram per cell).2. 基于色谱质谱联用的代谢物研究色谱质谱联用技术结合了色谱的高效、快速分离组分特点和质谱的物质定性鉴定和结构分析优势，具有高灵敏度和特异性高的特点[29, 50-53]。基于不同的前段色谱，色谱质谱联用技术包括气质联用（GC-MS、GC-TOF MS）、液质联用（LC-MS、
图 1-2 静脉注射前及 30 分钟后血清和脑脊液中甘露醇的浓度含量变化。每个样本均做 5次独立重复实验以计算平均值和标准差。Figure 1-2 Mannitol levels as measured in a) CSF and b) serum from three patients before and30 min after intravenous injection (p < 0.05, Wilcoxon signed-rank test). Five independentexperiments were performed for each sample to calculate the standard deviation (s.d.) as errorbars. Data were shown as the mean ±s.d. (n = 5)综上所述，通过采用合适的基质材料，激光解吸电离质谱能够准确地测定生物样品中的代谢小分子精准质荷比；同时只需对待检生物样品如血清、尿液及脑脊液等简单的预处理（如稀释）步骤或无需处理，而且检测速度快，适用于样本的高通量检测分析。因此本文采用激光解吸电离质谱方法（LDI MS）对生物样本中的代谢物小分子进行检测。1.1.3 数据处理方法
73-74]。Chen 等[26]利用 OPLS-DA 方法分别来评价训练组和盲测组中急性髓细胞样白血病（AML）与正常对照控制组（HC）的血清代谢物异同，结果发现两组间的代谢物有明显的差异，如图 1-3 所示。该研究为血清代谢物和代谢途径作为新的预后标志和潜在治疗靶点提供了有力的证据。而 S-plot 图则用于寻找区分组间差异标志物。S-plot 图中的 y 轴表示相关性（correlation），即区分两组的标志物的可靠性；x 轴表示协方差（covariance），即标志物在区分两组时的重要性。且 S-plot图中 “两翼”的相关性值协方差值最大，即区分两组的贡献值最大，相反，中心处的点贡献值很小，如图 1-4 所示[67]。通过该方法，Stolee 等[67]发现己糖（质荷比值为 203/219）和一些次生代谢产物，如蒜氨酸（质荷比值为 178）主要积累在细胞质中；与此相反，一些氨基酸（如质荷比值为 147 的谷氨酰胺和质荷比值为 175的精氨酸）则在细胞核中更容易检测到。采用该方法时要注意标志物的变异权重系数（variable importance in projection, VIP）的值要大于 1。
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 章成国;张国华;黄淑云;;急性缺血性卒中NEW-TOAST分型各亚型与血糖的关系[J];中华神经科杂志;2011年10期
相关博士学位论文 前1条
1 张小丽;基于多种分析技术的代谢组学方法研究与应用[D];兰州大学;2013年
本文编号：2751003
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