临床分离鲍曼不动杆菌耐药性和毒力的关联性研究

发布时间：2020-07-14 21:15

【摘要】：目的:研究临床分离的泛耐药鲍曼不动杆菌与敏感鲍曼不动杆菌的毒力差异以及泛耐药鲍曼不动杆菌形成生物膜前后毒力的区别,为临床管理和控制泛耐药鲍曼不动杆菌提供理论基础。方法:用不同浓度的菌液经腹足注射至大蜡螟幼虫体内,以检测泛耐药鲍曼不动杆菌菌株和敏感鲍曼不动杆菌菌株对大蜡螟幼虫表现出的毒力区别;采用体外竞争实验,涂板计数法计算各组菌落数,分别比较两菌在体外单独生长的情况下,以及等浓度混合生长时生长能力的差别;另外,用鲍曼不动杆菌在大蜡螟幼虫体内竞争实验模型,计算各时间点虫体血淋巴细菌负荷,比较两菌单独感染大蜡螟幼虫及混合后感染大蜡螟幼虫时对大蜡螟血淋巴载菌量浓度的差别。将巨噬细胞RAW264.7培养后,分别接种泛耐药鲍曼不动杆菌和敏感鲍曼不动杆菌菌液,酶标仪A450测定各组数值后,利用公式计算各组巨噬细胞的存活率,比较两组菌株对巨噬细胞的侵袭能力。分别将浮游状态下的泛耐药鲍曼不动杆菌菌液与生物膜状态下的鲍曼不动杆菌菌液以最适接种浓度通过腹足注射至大蜡螟幼虫体内,检测浮游状态下泛耐药鲍曼不动杆菌和生物膜状态下鲍曼不动杆菌对大蜡螟幼虫的毒力。将巨噬细胞RAW264.7培养后,接种浮游状态和生物膜状态下的泛耐药鲍曼不动杆菌菌液,用酶标仪A450测定各组数值,计算各组巨噬细胞存活率,比较两组菌株对巨噬细胞的侵袭能力。结果:经菌株最适接种量实验结果可得出,随着感染浓度的增加,幼虫存活个数下降的越明显;对照组接种磷酸缓冲盐溶液(PBS)的大蜡螟幼虫96h内未见死亡;根据大蜡螟幼虫生存曲线,可以确定泛耐药鲍曼不动杆菌菌株对大蜡螟幼虫的半数致死量(LD_(50))为(1.311±0.213)×10~5CFU,敏感鲍曼不动杆菌菌株对大蜡螟幼虫的半数致死量(LD_(50))为(1.262±0.112)×10~4CFU,最适接种浓度定为1.×10~5CFU/mL。在不同耐药性的鲍曼不动杆菌对大蜡螟幼虫毒力实验可观察到,给予最适接种浓度,在24h与72小时时间点观察到,大蜡螟幼虫的存活个数存在统计学差异(P0.05),并且泛耐药鲍曼不动杆菌组的大蜡螟幼虫存活个数高于敏感鲍曼不动杆菌组。体外生长竞争实验,两菌株混合培养24h后,泛耐药鲍曼不动杆菌菌液浓度较敏感鲍曼不动杆菌菌液浓度低0.484 Log of CFU/mL,体外环境下混合培养后,菌液浓度有统计学差异存在(P0.05)。两组菌株的混合液感染大蜡螟幼虫后,第12h时与24h时,敏感鲍曼不动杆菌菌液浓度和泛耐药鲍曼不动杆菌菌液浓度两者比较后有统计学差异存在(CI_(12)=O.813,CI_(24)=0.872,P0.05);不同测量时间及不同菌株在大蜡螟幼虫体内环境下混合生长后,大蜡螟幼虫血淋巴细菌负荷浓度有统计学差异存在(P0.05)。敏感鲍曼不动杆菌和泛耐药鲍曼不动杆菌单独感染巨噬细胞后,巨噬细胞的存活率逐渐下降,24小时后,敏感与泛耐药鲍曼不动杆菌的巨噬细胞成活率比较结果有统计学差异,并且泛耐药鲍曼不动杆菌组的巨噬细胞存活率低于敏感鲍曼不动杆菌组。在26株临床分离的泛耐药菌株,有16株经诱导可产生生物膜,占泛耐药鲍曼不动杆菌的比例为61.54%。在大蜡螟幼虫的存活率试验中可观察到,浮游状态与生物膜状态下泛耐药鲍曼不动杆菌感染大蜡螟幼虫的存活个数在统计学上并无明显差异。接种PBS的大蜡螟幼虫96h内未见死亡,但将不同时间点的交互作用输入进统计学分析软件后,可得出P=0.000,所以,泛耐药鲍曼不动杆菌成膜前后在不同测量时间情况下接种后的大蜡螟幼虫存活个数之间有统计学差异存在。浮游状态和生物膜状态菌株分别感染巨噬细胞后,巨噬细胞的存活率逐渐下降,24小时后,结果经统计学分析可得,浮游组的巨噬细胞成活率为(95.232±1.828)×100%,生物膜组的巨噬细胞存活率为(99.691±1.097)×100%,P=0.0346,可知成膜前后泛耐药鲍曼不动杆菌的巨噬细胞成活率比较后,差异有统计学意义。结论:单独存在的情况下,泛耐药鲍曼不动杆菌组的毒力强于敏感鲍曼不动杆菌组,主要表现为感染后使大蜡螟幼虫及巨噬细胞RAW264.7的存活率下降;混合情况下,泛耐药鲍曼不动杆菌的生物适合度代价主要表现在该组菌株在体内、外生长竞争力下降,并且对大蜡螟幼虫及巨噬细胞RAW264.7的毒力减弱。浮游状态下泛耐药鲍曼不动杆菌与生物膜状态下的泛耐药鲍曼不动杆菌的毒力有统计学差异存在,在浮游状态下泛耐药鲍曼不动杆菌对大蜡螟幼虫及巨噬细胞RAW264.7的毒力强于生物膜状态下的泛耐药鲍曼不动杆菌。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R446.5
【图文】：

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的生存率均表现出不同程度的明显下降。在同一时间点上，随着度的增大，大蜡螟幼虫的生存力逐渐下降。接种 PBS 的大蜡螟未见死亡。大蜡螟幼虫的生存曲线显示（图 2.1、图 2.2。），泛耐杆菌对大蜡螟幼虫的半数致死量为（1.311±0.213）×105CFU，动杆菌对大蜡螟幼虫的半数致死量为（1.262±0.112）×104CFU。果显示数据分布不符合球形检验（MauchlyW=0.039,P=0.001），一元方差分析结果为准。使用 Greenhouse-Geisser 校正后，同一间点内不同浓度之间大蜡螟幼虫的存活数存在统计学差异（F=116）。进一步考虑不同时间点与组别之间的交互作用后，不同测量浓度的大蜡螟幼虫存活数之间的差异无统计学意义显著（F=11.9），根据生存曲线将最适接种浓度定为 1.0×106CFU/mL。

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图 2.2 不同浓度的敏感鲍曼不动杆菌感染蜡螟幼虫后的生存曲线Figure 2.2 Survival curve of Acinetobacter baumannii infected with Galleria mellonella larvae different concentrations 不同耐药性菌株对大蜡螟幼虫的毒力实验予最适接种浓度后，不论感染敏感鲍曼不动杆菌菌株还是泛耐药杆菌菌株，大蜡螟幼虫的生存率均表现出不同程度的明显下降。泛不动杆菌与敏感鲍曼不动杆菌感染第 48h 与第 96h，大蜡螟幼虫的并无显著的统计学差异差异（48h：泛耐药组 vs. 敏感组，P＞0.99泛耐药组 vs. 敏感组，P＞0.999）。但在第 24h 与第 72h 时，泛耐药杆菌组与敏感鲍曼不动杆菌组的大蜡螟幼虫存活个数存在统计学h：泛耐药组 vs.敏感组，P=0.0131；72h: 泛耐药组 vs.敏感组，P=0.02.3，表 1）.接种 PBS 的大蜡螟幼虫 96h 内未见死亡（未在图中标出

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临床分离鲍曼不动杆菌耐药性和毒力的关联性研究硕士学表 1：不同耐药性菌株对大蜡螟幼虫的毒力实验Table The virulence test of different drug resistant strains to the Galleria mellonella larvae菌株 24 小时 48 小时 72 小时 96 小时 P 总泛耐药 7.11±0.900 5.42±1.027 3.81±0.963 0.27±0.4520.00敏感型 7.23±0.652 5.72±1.179 4.68±0.935 0.33±0.485t 2.856 1.149 3.973 0.246P 0.0131 ＞0.999 0.0029 ＞0.999注：P 值为同一测试时间点用独立样本 t 检验法两两比较之后的结果，P总为单因素重复测量析的最终结果。

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