MHCⅡ基因对内皮祖细胞移植治疗ARDS的影响

发布时间：2020-07-15 02:23

【摘要】：目的:探讨外周血炎症因子及肺组织MHCⅡ基因在脂多糖(LPS)致急性呼吸窘迫综合征(ARDS)模型小鼠体内的表达量改变,通过研究炎症反应通路探讨慢病毒转染沉默肺组织MHCⅡ基因对内皮祖细胞移植(EPCs)治疗ARDS的作用,为治疗ARDS提供新思路。方法:选78只昆明白雄性小鼠,随机分为4组,(1)正常对照组(NC组)(2)脓毒症模型组(LPS组)(3)内皮祖细胞移植组(LPS+EPCs组)(4)MHCⅡ慢病毒干扰组(LPS+MHCⅡ-+EPCs组)。ARDS模型建立:以12mg/kg向(2)(3)(4)组小鼠尾静脉注射LPS,建立脓毒模型;1小时后向(3)组小鼠尾静脉注射200ul EPCs;向(4)组小鼠尾静脉注射MHCⅡ慢病毒100ul,观察1小时后,再向(4)组小鼠尾静脉注射200ul EPCs。模型建立第三天(d3),(3)与(4)组,用10%苯巴比妥浅麻醉后活体成像仪上荧光示踪;d3及d7各组小鼠麻醉解剖,留取肺组织行HE染色及快速冰冻切片,观察各组显微镜下病理改变及荧光定位情况;外周血酶联免疫吸附试验法(Elisa)方法检测炎性因子TLR-4、NF-KB、IL-12、TNF-a的表达量;荧光定量PCR(RT-PCR)检测TLR-4以及MHCⅡ mRNA表达情况;蛋白免疫印迹法(Western blot)方法检测MHCⅡ蛋白的表达情况。多组间数据分析采用方差分析,Pearson法分析相关性。结果:1、组织病理结果:NC组肺组织结构正常,LPS组肺泡及间质结构紊乱无序,炎性浸润及纤维素样渗出,肺泡及毛细血管腔出血狭窄,呈现大面积水肿及炎症细胞浸润损伤;LPS+EPCs组较LPS组损伤减轻;LPS+MHCⅡ-+EPCs组炎性细胞浸润减少,肺泡及间质结构基本完整。2、EPCs及MHCⅡ慢病毒示踪结果:LPS+EPCs组与LPS+MHCⅡ-+EPCs组组肺组织快速冰冻切片均可见标记EPCs及MHCⅡ慢病毒的绿色荧光表达,活体显像也可见标记EPCs及MHCⅡ慢病毒的荧光主要在胸部表达。3、Elisa法检测炎性因子TLR-4、NF-KB、IL-12、TNF-a表达,在NC组、LPS组、LPS+EPCs组、LPS+MHCⅡ-+EPCs组表达量d3分别为(1.56±0.111、38.0±11.0、0.244±0.0794、24.9±4.05)pg/m L,(2.98±0.187、273±27.6、5.36±0.658、107±18.1)pg/m L,(2.54±0.182、125±27.3、2.23±0.763、71.4±8.13)pg/m L,(1.81±0.201、59.0±15.6、0.531±0.150、44.1±4.81)pg/m L。d7分别为(1.54±0.129、2.90±0.194、2.33±0.159、1.63±0.166)pg/m L,(36.7±11.7、233±28.9、111±42.0、44.1±13.9)pg/m L,(0.292±0.0510、2.94±0.696、1.57±0.439、0.356±0.0783)pg/m L,(24.0±4.33、85.0±15.6、63.6±11.6、32.7±5.23)pg/m L。LPS组较NC组均表现升高(均P0.0001),而LPS+EPCs组及LPS+MHCⅡ-+EPCs组较LPS组均表现降低(均P0.0001),且LPS+MHCⅡ-+EPCs组较LPS+EPCs组又表现明显降低(均P0.0001),LPS+MHCⅡ-+EPCs组较NC组无明显差异(P0.05)。d3与d7无明显差异(P0.05)。4、RT-PCR检测TLR-4、MHCⅡ mRNA表达,在NC组、LPS组、LPS+EPCs组、LPS+MHCⅡ-+EPCs组d3分别(89.1±55.6、0.303±0.0821),(2222±924、5.62±0.819),(743±351、2.98±0.773),(174±91.2、0.526±0.0745)。d7分别为(93.9±62.3、0.286±0.0639),(1533±688、4.55±0.697),(592±144、2.88±0.682),(156±85.5、0.464±0.109)。LPS组较NC组表达量均表现升高(均P0.0001),而LPS+EPCs组及LPS+MHCⅡ-+EPCs组较LPS组表达量均表现降低(均P0.0001),且LPS+MHCⅡ-+EPCs组较LPS+EPCs组表达量又明显降低(均P0.0001),LPS+MHCⅡ-+EPCs组较NC组无明显差异(P0.05)。5、western blot检测MHCⅡ蛋白表达,NC组、LPS组、LPS+EPCs组、LPS+MHCⅡ-+EPCs组,d3分别为(0.356±0.0669),(1.49±0.310),(0.924±0.200),(0.544±0.0558)LPS组较NC组MHCⅡ蛋白灰度值均升高(均P0.0001),而LPS+EPCs组及LPS+MHCⅡ-+EPCs组较LPS组MHCⅡ蛋白灰度值均表现降低(均P0.0001),且LPS+MHCⅡ-+EPCs组较LPS+EPCs组MHCⅡ蛋白灰度值又表现明显降低(均P0.0001),LPS+MHCⅡ-+EPCs组较NC组无明显差异(P0.05)。6、d3实验模型中LPS组MHCⅡ与TLR4、NF-κB、TNF-a、IL-12均呈正相关(r2=0.824、0.867、0.763、0.830,且均p0.05),同时TLR4在基因及蛋白水平呈强正相关(r2=0.991,且均p0.001);LPS+EPCs组MHCⅡ基因相对表达量与IL-12、MHCⅡ蛋白、TLR4 mRNA及其蛋白、NF-κB均呈正相关(r2=0.824、0.880、0.978、0.978、0.938,且均p0.05),同时TLR4在基因及蛋白水平呈强正相关(r2=0.998,且p0.001);LPS+MHCⅡ-+EPCs组MHCⅡ基因相对表达量与IL-12、MHCⅡ蛋白、NF-κB、TNF-a、TLR4蛋白均呈正相关(r2=0.965、0.926、0.846、0.795、0.875,且均p0.05),同时TLR4在基因及蛋白水平呈强正相关(r2=0.998,且p0.001)。结论:1、脓毒所致ARDS时炎症因子TLR-4、NF-KB、IL-12、TNF-a明显增高;肺组织MHCⅡ基因及蛋白表达明显增高,TLR-4基因及蛋白表达明显增高;MHCⅡ与TLR-4、NF-KB、IL-12、TNF-a明显正相关。2、EPCs移植可以部分减少TLR-4、NF-KB、IL-12、TNF-a及MHCⅡ的表达;MHCⅡ与TLR-4、NF-KB、IL-12明显正相关。3、MHCⅡ基因干扰后进行EPCs移植,可以明显抑制TLR-4、NF-KB、IL-12、TNF-a及MHCⅡ的表达;且均较单独EPCs移植组明显下降;MHCⅡ与TLR-4、NF-KB、IL-12、TNF-a依然表现为正相关。
【学位授予单位】：内蒙古医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R459.7
【图文】：

内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2019） 212.1 sepsis 模型鉴定向 30g 雄性小鼠体内尾静脉注射 LPS，经过前期造模摸索条件后以 12mg/kg注射效果最佳，光学显微镜镜下病理切片改变可见 d3 及 d7 与正常组对比显示肺泡上皮以及毛细血管上皮周围浸润大量中性粒细胞，淋巴细胞等炎性细胞，并有炎性渗出、充血水肿、透明膜形成，肺泡腔内狭窄及“气球样”改变，肺间质正常结构消失，出现弥漫性的肺泡损伤改变，d3 损伤评分为 10 分，d7 损伤评分 20分。

图 2 4 种病毒转染巨噬细胞结果注：如图 2 所示，从左到右分别为 LV3-Ciita-Mus-408、LV3-Ciita-Mus-1057、LV3-Ciita-Mus-2001 、LV3-NC、空白对照。将 4 种病毒侵染后的巨噬细胞提取 RNA，进行 RT-PCR 检测，由表 5、图 3可见 LV3-Ciita-Mus-408 沉默效果最好，故选择其作为后续实验的干扰病毒。表 5 4 种病毒在小鼠巨噬细胞 mRNA 表达情况LV3-NC LV3-Ciita-Mus-408LV3-Ciita-Mus-2001LV3-Ciita-Mus-1057mRNA 相对表达量1 0.401±0.026 0.757±0.207 0.653±0.184F 值 7.285P 值 0.025

图 3 4 种病毒在小鼠巨噬细胞 mRNA 表达情HE 染色结果组模型建立 d3，镜下可见 LPS 组较 NC 组肺泡及纤维素样渗出，肺泡及毛细血管腔出血狭窄， LPS 组损伤减轻、较 NC 组损伤减轻更明显，但PCs 组较 LPS 组炎性浸润减轻、较 LPS+EPCs 组-+EPCs 组较 NC 组无明显差异。模型建立 d7，镜间质水肿、充血明显，LPS+EPCs 较 LPS 组损显，但依旧没有恢复正常。LPS+MHCII-+EPCsPS+EPCs 组又进一步减轻，且 LPS+MHCII-+Ed3 与 d7 各组进行比较，NC 组、LPS 组、LP 组各组均无明显差异。

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本文编号：2755832