多来源MSCs对单倍体造血干细胞移植救治重度骨髓型放射病GVHD调节作用的比较研究

发布时间：2020-07-23 22:59

【摘要】：急性放射病(acute radiation sickness,ARS)是机体在短时间内受到大剂量电离辐射照射引起的全身性疾病。其中骨髓型急性放射病(1Gy剂量10Gy)是辐射损伤最为常见,也最易治疗的一种类型。造血干细胞移植是目前临床治疗此病的主要方法,但实际应用中仍受到造血干细胞来源少、GVHD严重等因素的制约。因此,扩大造血干细胞来源,改善移植后GVHD对造血干细胞移植治疗急性放射病有重要作用。单倍体造血干细胞来源广泛,能有效解决造血干细胞来源少,配型时间长的问题。但单倍体造血干细胞移植仍然面临植入失败率高、GVHD重、移植相关死亡率高等诸多障碍。提高植入率、抑制GVHD发生是现在急需解决的问题。间充质干细胞具有免疫抑制、支持造血干细胞扩增的作用,在造血干细胞移植中的辅助作用越来越受到重视。现在骨髓、脐带、真皮、脂肪等来源的间充质干细胞均已被分离鉴定,因此,本课题将不同来源的间充质干细胞联合单倍体造血干细胞移植来治疗重度骨髓型放射病,从造血重建、GVHD防治方面比较各种间充质干细胞的优劣,并对其机制进行初步探讨,为间充质干细胞的临床应用提供实验依据。一、主要研究内容与方法:1、构建单倍体移植重度骨髓型放射病模型。采用C57BL/6(H-2b)与BALB/C(H-2d)杂交第一代(H-2b×d)小鼠作为受体,C57BL/6(H-2b)作为供体。设置不同剂量的辐照强度,对不同剂量辐照的小鼠进行移植,观察并检测小鼠造血重建、生存率、临床评分、移植后嵌合率、骨髓细胞集落形成能力及病理。2、体外分离培养骨髓,脐带,真皮和脂肪间充质干细胞,采用分子标记(CD14/CD20/CD34/CD45,CD105,CD73,CD90)和成骨成脂分化能力检测其间充质干细胞的纯度。将传代培养的间充质干细胞与人外周血T细胞共培养,观察T细胞的周期、增殖以及细胞亚群变化。3、构建间充质干细胞联合单倍体造血干细胞移植重度骨髓型放射病GVHD模型。设置不同剂量间充质干细胞(0.5×10~6、1×10~6和5×10~6),检测移植后体重变化、生存率。利用CM-DIL标记间充质干细胞,冰冻切片检测间充质干细胞在小鼠体内的归巢情况。4、将四种来源的间充质干细胞联合单倍体造血干细胞分别移植重度骨髓型放射病GVHD模型小鼠,检测移植后造血重建能力、生存率、临床评分。取移植后第28天小鼠GVHD靶器官,行病理切片HE染色和免疫组化检测CD4和CD8的表达;检测小鼠第28天T细胞亚群情况;检测外周血血清中各细胞因子的表达情况。5、取对数期生长的各种间充质干细胞,抽提RNA后,进行RNA-seq测序,分析不同间充质干细胞基因表达的差异。二、结果:1、选择800c Gy作为辐照剂量,成功构建单倍体移植重度骨髓型放射病模型。2、成功分离培养四种间充质干细胞的鉴定结果显示,四种细胞的分子标记均符合间充质干细胞标准(CD14/CD20/CD34/CD45-,CD105+,CD73+,CD90+)且均能诱导分化为骨细胞和脂肪细胞。共培养结果显示四种细胞均能抑制T细胞增殖,增加G1期细胞比例。共培养后T细胞亚群检测发现,四种细胞均能抑制Th1、促进Th2增殖,且能提高Treg细胞的比例,其中HUCMSCs效果最显著。3、成功构建间充质干细胞联合单倍体造血干细胞移植重度骨髓型放射病GVHD模型。采用CM-DIL标记后的脐带间充质干细胞进行联合移植,结果显示脐带间充质干细胞能归巢到脾脏、肝脏、肺和骨髓,其中骨髓最为丰富。4、联合移植后结果显示,间充质干细胞联合移植组生存率增加,临床评分降低,HUCMSCs明显优于其他各组(P0.05)。病理与免疫组化结果显示,间充质干细胞能明显减轻GVHD。CD4在模型小鼠的皮肤和肺中浸润较多,CD8在小肠中有大量表达。T细胞亚群检测显示HUCMSCs组和DMSCs组Th1细胞较GVHD组明显降低(P0.05),Th2细胞明显增多(P0.05),BMSCs组和Ad-MSCs组与GVHD组无显著差异。Treg细胞检测发现各间充质干细胞组较GVHD组Treg细胞显著升高(P0.05),其中HUCMSCs组和BMSCs组与GVHD组差异最大(P0.01);外周血血清检测显示IFN-γ、IL-2和TNF-α在正常组的表达水平均较低,GVHD组明显升高(P0.01),四种间充质干细胞组均比GVHD组明显降低(P0.05);IL-4检测显示GVHD组较正常组明显升高(P0.05),HUCMSCs组、DMSCs组和BMSCs组均比GVHD组高(P0.01)。5、RNA-seq结果显示HUCMSCs与BMSCs、DMSCs和Ad-MSCs基因表达明显不同,与GVHD、细胞粘附、细胞因子以及新陈代谢相关的通路有较大差异。三、结论:1、单倍体造血干细胞移植能有效治疗重度骨髓型放射病。2、间充质干细胞联合移植能有效减轻GVHD,提高生存率,其中HUCMSCs效果最好。3、HUCMSCs与其他三种间充质干细胞的基因表达不同,特别是与GVHD、细胞粘附和细胞因子相关通路的不同,可能是HUCMSCs效果较好的重要原因。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R818;R457.7
【图文】：

模型小鼠,生存曲线,造血组织,存活率

500cGy、600cGy 和 700cGy全部存活，800cGy 组存活率为 60%，900cGy 组存活率为 20%（图1-1）。图 1-1 不同剂量辐照后模型小鼠生存曲线。左图为单纯注射 PBS 组（PBS control），右图为造血干细胞移植组（HCT）各组分别于移植后第 7 天对各 PBS 组行骨髓病理切片，观察骨髓组织造血情况，观察发现，800cGy 和 900cGy 组小鼠骨髓造血组织明显减少，增生程度降低，骨小梁破坏，有核细胞数量减少。而 500cGy、600cGy 和 700cGy 造血组织同样有所减少，但不明显（图 1-2）。

体重变化,模型小鼠,持续下降,体重

图 1-2 移植后第 7 天各 PBS 组骨髓病理（HE，200×）1.2.1.2 体重变化辐照后各组小鼠体重均有一个急性下降期，PBS 组在辐照后体重持续下降，存活的小鼠体重在第 14 天缓慢回升。各移植组在 7-14 天均有不同程度回升（图 1-3）。图 1-3 不同剂量辐照后模型小鼠体重变化。左图为单纯注射 PBS 组（PBS control），

模型小鼠,体重变化,造血干细胞移植,外周血象

22图 1-3 不同剂量辐照后模型小鼠体重变化。左图为单纯注射 PBS 组（PBS control），右图为造血干细胞移植组（HCT）1.2.1.3 外周血象照射后第 7 天，各组分别于移植后第 1、3、5、7、10、14、21、28 天监测血象变化。第 1-5 天，各造血干细胞移植组外周血象急剧下

【参考文献】