丙肝NS4B蛋白诱导肝细胞上皮细胞间质改变的机制研究

发布时间：2020-07-25 11:53

【摘要】：目的:探讨丙肝非结构蛋白NS4B在上皮细胞间质改变中所起的作用,以及其分子机制。方法:1.用高保真Taq酶从含有全长1b型HCV质粒中扩增出NS4B片段,运用Eco RI和Bam HI双酶切法构建重组的PEGFPC1-NS4B质粒,q RT-PCR、Westernblot、细胞免疫荧光方法检测质粒是否可在真核细胞表达丙肝NS4B蛋白;2.用阳离子脂质体将空质粒和重组质粒转染进入HepG_2细胞中进行表达,或在HepG_2细胞中分别转染空质粒,1μg,3μg,5μg重组质粒,48h后,q RT-PCR、Western blot来检测E-cadhrin、N-cadherin基因和蛋白表达变化,以观察HepG_2细胞是否发生上皮细胞间质改变;3.与2中相同的方法检测HepG_2细胞中转录因子Snail基因和蛋白变化,并且通过sh RNA沉默snail的表达以观察snail在丙肝NS4B导致的上皮细胞间质改变中所起的作用;4.用细胞划痕实验观察转染了丙肝NS4B重组质粒及共转染重组质粒和Snail sh RNA的HepG_2细胞迁徙能力的改变;5.Westernblot检测Scribble-Hippo-PI3K/AKT信号通路变化,以探究丙肝NS4B蛋白引起上皮细胞间质改变分子机制。结果:1.测序及双酶切鉴定结果显示读码框和插入方向完全正确,并且在两端成功插入了起始密码子和终止密码子,双酶切片段结果为4725bp和796bp长度两个片段,鉴定结果显示目的基因已经插入PEGFPC1空质粒中,重组PEGFPC1-NS4B质粒可在HepG_2细胞中瞬时表达。2.转染了重组NS4B质粒的HepG_2细胞相较于对照组而言,q RTPCR显示E-cadhrin m RNA表达下调、N-cadherin m RNA表达上调。Western blot结果显示E-cadhrin蛋白水平表达下调、N-cadherin蛋白水平表达上调。同时E-cadhrin的蛋白表达随着丙肝NS4B表达的增加而减少,N-cadherin蛋白的表达随着丙肝NS4B表达的增加而增加,说明NS4B蛋白表达是引起上皮细胞间质改变的根本原因。3.转染了重组NS4B质粒的HepG_2细胞相较于对照组而言,Westernblot结果显示转录因子Snail表达上调,且Snail随着丙肝NS4B蛋白表达增加而增加,但q RT-PCR结果显示表达丙肝NS4B组和对照组其snail m RNA表达水平相差不大,说明Snail蛋白变化发生于转录后水平;沉默snail表达可扭转HepG_2细胞上皮细胞间质改变。4.转染了重组NS4B质粒的HepG_2细胞迁徙能力较未转染组增强,而共转染NS4B质粒和Snail sh RNA的HepG_2细胞迁徙能力并未明显增加。5.转染了重组NS4B质粒的HepG_2细胞与对照组相比,可与Scribble蛋白相互作用并导致其表达下调,Scribble下游Hippo信号通路中pyap蛋白表达下调,但total-yap表达无明显变化,p-yap/total-yap减少,Hippo信号通路被抑制,而p-akt表达上调,total-akt表达下调,p-akt/total-akt表达增加,说明Hippo下游通路PI3K/AKT信号通路被激活,这可能是丙肝NS4B导致肝细胞上皮细胞间质改变的分子机制。结论:丙肝非结构蛋白NS4B通过上调转录因子Snail的表达进而导致肝细胞上皮细胞间质改变,且可能通过Scribble-Hippo-PI3K/AKT通路引起Snail表达变化。
【学位授予单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R446.6;R512.63
【图文】：

丙肝病毒,蛋白加工,多肽酶,蛋白

coding region,NCR)，在病毒复制中起着重要的调节作用，5’端 UTR具有内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site, IRES)，可介导HCV 病毒复制[9]，HCV ORF 含有 9个基因区，可编码十个 HCV 蛋白，这十个蛋白包括三个结构蛋白(核心蛋白、包膜蛋白 E1 和 E2)，和一个穿孔蛋白 p7 以及 6个非结构蛋白(NS2, NS3, NS4A, NS4B,NS5A, NS5B)(图 1)[10]，这些蛋白在 HCV 生活史中均发挥着重要的作用：E1和 E2 蛋白在 HCV 进入宿主细胞过程中起着重要的作用；核心蛋白构成 HCV 核衣壳并且与多种宿主蛋白相互作用导致慢性化和 HCC 的发生[11]；p7 和 NS2 参与 HCV 病毒组装和释放[12]；NS3-NS5B 蛋白构成病毒复制酶体并且也参与丙肝病理变化过程[13]。

信号通路,哺乳动物,果蝇

信号通路o 信号通路是与器官大小、组织再生和肿瘤的发生抑制信号相关途径，主要成分包括 YAP（Yes -a、Lats1/2、Mob、 Mst1/2、Sav、Merlin、Ex1/2 和磷酸化级联放大途径。磷酸化的 Hpo(哺乳动物 m，活化的 Hpo 能磷酸化 YKI(哺乳动物为 YAP)，活，进而滞留于细胞质间，可阻止 YKI 与 scallopax 等转录因子结合，进而阻止 hippo 通路靶向基因DIAP1 等蛋白的表达，这些蛋白均有促进生长和ippo 信号通路图见图 2。

非结构蛋白,蛋白,RNA复制,位点

HCV 诱导的 DMVs 模型及假想的膜与各蛋白之间的关系(注：DMVs 含有V 非结构蛋白和 HCV RNA，为 RNA 复制位点，DMVs 含有一开口，以便病NA、非结构蛋白和细胞质交换)[42]HCV NS4B 蛋白可以改变细胞内脂质的合成，NS4B 蛋白可通过 PI3K/AKT 途径刺激固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatoryment binding proteins, SREBPs)和脂肪合成酶的表达，以此诱导Vs 的形成[43]。DMVs 的形成也需要宿主蛋白的参与，NS4B蛋白NS5A 相互作用，可招募 PSTPIP2 蛋白到达 HCV 构造的膜上，当TPIP2 被敲出时，DMVs 的形成受阻[44]。NS4B蛋白还可和其他非蛋白相互作用以完成病毒复制周期，如 NS4B与 NS5A 相互作减少 NS4B向内质网腔内转位[45]。NS4B C 末端的 walker B 基序

【相似文献】