iPSC-MSC来源的外泌体通过miR-125b-5p抑制TRAF-6减轻LPS诱导肺泡巨噬细胞炎症反应

发布时间：2020-07-30 10:34

【摘要】：目的:观察iMSC-Exo对LPS诱导AM炎症反应的抑炎作用,初步探讨iMSC-Exo发挥抑炎作用的分子机制。方法:体外培养iMSC,采用旋转超滤法提取细胞上清液中的iMSC-Exo,并利用透射电子显微镜(TEM)、高分辨率可调电阻脉冲(TRPS)、蛋白免疫印迹技术对其进行鉴定;体外培养AM,分别予PBS、iMSC-Exo、LPS、LPS+iMSC-Exo处理;通过第二代高通量测序技术比较LPS组和LPS+iMSC-Exo组间的差异miRNAs表达谱;将miR-125b-5p mimic或inhibitor转染至LPS+iMSC-Exo诱导的AM中;采用ELISA检测各组AM上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量,采用qRT-PCR技术检测各组AM中TNF-α、IL-1β、IL-6并验证miR-125b-5p在AM中及iMSC-Exo内的表达情况;Western Blot技术检测各组AM中TRAF-6、NF-κB(p65)、p-p65的蛋白表达情况;采用免疫荧光观察iMSC-Exo与AM中的共定位情况及细胞中TRAF-6的荧光表达。结果:(1)透射电镜下观察提取的iMSC-Exo为圆形或椭圆形的膜性小囊泡,粒子直径大约为40-100nm,且表达外泌体蛋白标志物CD9及CD63。(2)将iMSC-Exo与LPS预刺激的AM共培养24h后,上清液和细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白及mRNA含量较LPS组相比均明显降低;荧光显微镜下可见荧光标记的iMSC-Exo包绕在AM细胞核周围,提示iMSC-Exo能够被AM吞噬。(3)第二代高通量测序结果显示:以LPS+iMSC-Exo组与LPS组表达比值≥2倍作为差异表达的miRNAs,LPS+iMSC-Exos分别刺激AM 6h和24h后,上调2倍以上的miRNAs分别有90个和30个,其中包括miR-125b-5p、miR-9b-3p、miR-135a-5p等12个miRNAs表达水平于两时间点均发生显著上调,筛选出与炎症反应相关的miRNAs在体外进行验证,发现miR-125b-5p上调最明显,且miR-125b-5p在iPSC-MSC-Exo中也为高表达水平。(4)通过对LPS+iMSC-Exo诱导的AM转染miR-125b-5p mimic过表达miR-125b-5p,能够显著增强iMSC-Exo对LPS诱导AM炎症反应的抑炎作用;而通过转染miR-125b-5p inhibitor沉默miR-125b-5p,则能够削弱iMSC-Exo对LPS诱导AM炎症反应的抑炎作用。(5)生物信息学分析预测提示TRAF-6基因的3’-UTR与miR-125b-5p的种子区存在互补配对序列;双荧光素酶报告基因验证发现转染miR-125b-5p可使野生型TRAF6-3’UTR载体的荧光素酶活性降低约30%,而对突变型TRAF6-3’UTR载体的荧光素酶活性无明显影响。(6)将iMSC-Exo与LPS预刺激的AM共培养24h后,AM中的TRAF-6、P-P65蛋白表达水平较LPS组均显著下降,而NF-κB的蛋白水平无明显变化。(7)对LPS+iMSC-Exo诱导的AM转染miR-125b-5p mimic过表达miR-125b-5p,TRAF-6及P-P65蛋白表达水平较阴性对照组均下降;而转染miR-125b-5p inhibitor沉默miR-125b-5p,使得AM中TRAF6蛋白表达上调,NF-κB核移位增加。结论:iMSC-Exo通过miR-125b-5p靶向TRAF-6,抑制AM中NF-κB炎症信号通路的激活,减轻LPS诱导的AM炎症反应。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R459.7
【图文】：

1iMSC-Exo的鉴定

炎症反应,炎症因子,技术检测,模型建立

第 3 章结果诱导 AM 炎症反应模型建立成功；与 LPS 组相比，LPS+iMSC-Exo 组 AM 炎症因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α含量均明显降低（分别为 120.33±16.21 pg/ml vs202.33±11.47 pg/ml、139.67±11.95 pg/ml vs 256.33±24.90 pg/ml、290.33±26.67pg/ml vs 440.00±28.61 pg/ml，P＜0.05），提示iMSC-Exo能够减轻LPS诱导的 AM炎症反应，见图 3.1.2A。采用 qRT-PCR 技术检测各组 AM 中炎症因子 IL-1β 、IL-6、TNF-α的 mRNA表达水平，结果显示：与 LPS 组相比，LPS+iMSC-Exos 组 AM 炎症因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α mRNA 表达水平均明显降低（分别为 1.66±0.10 vs 3.00±0.18、1.69±0.15 vs 2.67±0.18、2.49±0.35 vs 4.42±0.10，P＜0.05），见图 3.1.2 B。

iPSC-MSC来源的外泌体通过miR-125b-5p抑制TRAF-6减轻LPS诱导肺泡巨噬细胞炎症反应

3iMSC-Exo被AM摄取

【参考文献】