靶向肿瘤VCAM-1表达及其治疗反应的分子影像

发布时间：2020-08-02 06:04

【摘要】：目的:血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)是参与肿瘤演进的重要因子,在多种肿瘤细胞中均有表达。本实验旨在构建99mTc标记靶向VCAM-1单链抗体(scFv)的分子探针,探讨及评估其在不同肿瘤模型中特异性结合的能力以及靶向显像的可行性。方法:通过使用6-肼基烟酸琥珀酰亚胺酯盐酸盐(SHNH),将靶向VCAM-1 的 scFv(VCAM-1scFv)与 99mTc 连接进行标记。VCAM-1 的表达水平可通过不同细胞系(黑色素瘤细胞B16F10及A375m、纤维肉瘤细胞HT1080、卵巢癌细胞SKOV3.ip、乳腺癌细胞MDA-MB-231及肾癌细胞786-0)的免疫荧光染色进行验证。细胞摄取实验、体内单光子发射计算机断层(SPECT)显像和生物分布实验分别用以测定99mTc-6-肼基烟酰胺(HYNIC)-VCAM-1seFv在体内外与VCAM-1的结合能力。与此同时验证肿瘤组织中VCAM-1的表达。结果:99mTc-HYNIC-VCAM-1seFv 的标记率为 81.46±3.61%(n=5),纯化后的放射化学纯度为96.54±1.65%(n=5)。体外摄取实验表明,B16F10和HT1080细胞结合探针能力较强,4小时细胞摄取率分别为6.07±0.55%、5.73±0.41%(n=3),且不同肿瘤细胞对探针摄取能力与免疫荧光的VCAM-1表达水平较为一致。体内SPECT成像及生物分布表明,B16F10和HT1080 肿瘤摄取较高(4.93±0.52%ID/g,4.65±0.39%ID/g,4h),SKOV3.ip肿瘤呈中等摄取(2.99士0.44%ID/g,4h),A375m、MDA-MB-231 和 786-0 肿瘤组织摄取较低(1.33士0.22%ID/g、1.49±0.23%ID/g 及1.47±0.31%ID/g,4h)。B16F10肿瘤与其阻断组肿瘤1h摄取量分别为5.51±0.37%ID/g、2.92±0.26%ID/g(p0.001),表明 B16F10 肿瘤组织对99mTc-HYNIC-VCAM-1seFv高摄取可被过量的VCAM-1seFv抑制。与此同时,肿瘤组织荧光表达强度与肿瘤组织摄取有一定的相关性(R2=0.875,p0.001)。结论:99mTc-HYNIC-VCAM-1scFv能够在体内外检测VCAM-1的表达水平,为体内非侵入地评估VCAM-1的表达提供了新的手段。目的:血管细胞粘附分子-1(VascularCellAdhesionMolecule1,VCAM-1)在肿瘤生长及转移中起着至关重要的作用,逐渐成为肿瘤监测和治疗的新靶点。LY2409881是近年来发现的一种新型的IκB激酶β的抑制剂,可以诱导VCAM-1阳性表达的肿瘤细胞凋亡。本研究旨在评估68Ga标记的VCAM-1单链抗体(scFv)检测VCAM-1阳性肿瘤表达的能力,并探讨其监测LY2409881对VCAM-1阳性肿瘤治疗反应的可行性。方法:应用黑色素瘤细胞系B16F10和A375m分别制作VCAM-1过表达和低表达肿瘤模型。以1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)为放射性标记螯合剂,将VCAM-1 scFv与68Ga进行连接,构建新型示踪剂68Ga-NOTA-VCAM-1scFv。构建B16F10和A375m荷瘤鼠模型,尾静脉注射68Ga-NOTA-VCAM-1seFv后,分别进行microPET/CT成像、生物分布及放射自显影研究,用以探究该分子影像探针在肿瘤模型中的分布和靶向能力。以IKKs抑制剂LY2409881为靶向治疗药物,在体外B16F10细胞中评估其细胞毒性。体内实验中,B16F10荷瘤小鼠腹腔内注射LY2409881(每周两次,100mg/kg),对照组采用等体积的溶剂对照DMSO进行腹腔注射。每隔一天测量小鼠体重及肿瘤体积,同时取5只小鼠每周尾静脉注射68Ga-NOTA-VCAM-1scFv进行microPET/CT成像,动态监测评估治疗疗效。结果:68Ga-NOTA-VCAM-1seFv的标记率为95.00±1.34%(n=5),纯化后的放射化学纯度为97.80±1.65%(n=5)。microPET/CT显像、生物分布及放射自显影实验表明,68Ga-NOTA-VCAM-1seFv对表达VCAM-1p阳性的B16F10肿瘤亲和力较高(3hB16F10和A375m肿瘤摄取分别为5.17±0.68%ID/g、1.87±0.55%ID/g)。随着LY2409881浓度增加及作用时间延长,B16F10细胞活性逐渐降低,半数抑制浓度为17.69μM。体内动物模型实验也显示出该抑制剂对B16F10肿瘤生长具有明显的抑制作用(三周时治疗组肿瘤抑制率为51.76%)。在治疗监测过程中,microPET/CT显像及生物分布实验表明LY2409881治疗组在治疗后第一周肿瘤组织对68Ga-NOTA-VCAM-1seFv摄取减少(从5.02士0.25%ID/g降低至3.68±0.27%ID/g),第二周回到治疗前摄取水平。而在DMSO对照组中,肿瘤对68Ga-NOTA-VCAM-1seFv摄取保持相对稳定水平。结论:LY2409881作为IKK2抑制剂,可以有效地抑制VCAM-1表达及肿瘤生长。68Ga-NOTA-VCAM-1seFv作为显示VCAM-1表达的一种新型分子影像探针,制备简便、标记率高、稳定性好,图像清晰。68Ga-NOTA-VCAM-1scFv的PET显像可以用于VCAM-1阳性肿瘤分子表达的可视化探究,是监测恶性肿瘤LY2409881治疗效果的有效手段,具有良好的临床应用前景。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730.44
【图文】：

放射化学纯度,肿瘤细胞系,比活度,免疫荧光染色

比活度为邋１６．２３±１．１３ＭＢｑ／ｎｍｏｌ邋（？＝５）。纯化后，９９ｍＴｃ－ＨＹＮＩＣ－逡逑ＶＣＡＭ－ｌｓｃＦｖ的放射化学纯度为９６．５４士１．６５％，在ＦＢＳ和ＰＢＳ中１、３、６逡逑和１２小时后放射化学纯度均超过９０％邋（图１－１），具有良好的体外稳定逡逑性。逡逑灥１１１逡逑＾邋，逡逑Ｔｉｍｅ逡逑图１－１．邋９９ｍＴｃ－ＨＹＮＩＣ－ＶＣＡＭ－ｌｓｄＶ？ＦＢＳ和ＰＢＳ中不同时间点的稳定性。所逡逑有数据均表示为均值±ＳＤ邋（？＝５）。逡逑３．２体外ＶＣＡＭ－１表达逡逑通过免疫荧光染色评估６种肿瘤细胞系中ＶＣＡＭ－１表达水平（图１－逡逑２）。其中Ｂ１６Ｆ１０、ＨＴ１０８０细胞荧光强度较强，ＳＫＯＶ３ｉｐ细胞呈中等荧逡逑光强度，Ａ３７５ｍ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１和７８６－０细胞荧光强度较低。逡逑１６逡逑

免疫荧光染色,肿瘤细胞

肿瘤,和肝,肾脏,荷瘤鼠

荷瘤鼠尾静脉注射１、２、４小时进行显逡逑像，均可以清楚地看到Ｂ１６Ｆ１０和ＨＴ１０８０肿瘤显影，具有较好的肿瘤与逡逑背景对比（图１－４Ａ和１－４Ｂ）。同时，在ＳＫ０Ｖ３．ｉｐ肿瘤中可观察到肿瘤逡逑有明显的放射性浓聚（图１－４Ｃ），Ａ３７５ｍ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１和７８６－０肿瘤逡逑组织显像剂摄取（图１－４Ｄ、１－４Ｅ和１－４Ｆ）则较弱。如图１－５所示，Ｂ１６Ｆ１０逡逑肿瘤阻断显像时肿瘤组织显影不清，表明９９ｍＴｃ－ＨＹＮＩＣ－ＶＣＡＭ－ｌｓｅＦｖ可以逡逑特异性靶向ＶＣＡＭ－１阳性肿瘤。此外，肾脏和肝脏的图像清晰可见，说逡逑明探针在体内清除主要通过肾脏和肝脏途径。逡逑１８逡逑

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