基于微流控芯片及多模成像的白细胞分类检测方法研究

发布时间：2020-08-03 18:37

【摘要】：目的:白细胞分类检测是临床检验的重要指标,是疾病诊断的重要依据。目前实验室和医院大多使用全自动血液分析仪,这种设备具有计数准确性高、一次性可检测样本量大、检测指标多等优点,对于医院有大量病人和实验室里有大量样本需要检测的场合非常适用。但是此类设备在战现场救援、抗震救灾、基层诊疗及其它多种复杂环境下的应用上也具有很多局限性:(1)设备体大质重,导致携行性差;(2)设备内部结构精密复杂,抗振动能力差;(3)因为设备采用湿化学技术原理,需多种液体试剂耗材配套才能完成检验工作,试剂不便于储存并且液体试剂在低温环境下容易受冻失效;(4)所用配套耗材一般为上百人份用量,拆封后短期必须用完,否则将过期失效,不适用于患者量不多的环境下的血常规检测;(5)设备价格昂贵并且维护费用高,不适用于基层或边远艰苦地区使用。针对上述问题,本课题研究一种适用于POCT设备的白细胞分类检测系统,该系统具备操作简单、环境适应性好、无需专门维护和可快速输出检测结果等优势,既可用于医院床旁样本快速检测、基层医疗常规临床化验,也可用于战场或灾害现场等医疗卫生体系不完善,并且有大量伤病员需快速诊断的场合,可弥补传统血细胞分析仪的不足,为进一步研制成POCT白细胞分类设备提供技术支撑。研究内容与研究方法:通过详细分析课题所研制系统的主要功能与应用定位,针对新鲜人体血样这一检测目标,综合运用微流控芯片技术、多模成像光学检测技术以及BP神经网络算法,完成了白细胞自动分类检测系统的创建,然后以传统血液分析仪为对照,设计实验评价本系统对白细胞分类检测的准确度、精密度等关键指标。具体研究内容包括以下四个方面:1、血液样品处理和微流控芯片设计。首先需要对血液进行溶血和染色处理,溶血的目的是去除血液中红细胞对白细胞计数的干扰,并且不破坏白细胞整体结构,染色的目的是为了实现白细胞的成像检测功能,另外还需考虑血液与试剂反应时间不宜过长且效果稳定等因素,以确保系统对白细胞的检测快速、准确。其次对微流控芯片中微腔的设计需要考虑样本在不同光源照射下,白细胞的成像效果,微腔过厚会导致图像内细胞粘连严重,微腔过薄,则需增加检测视野面积,否则检测视野内细胞数量过少会导致丧失统计学意义,因此必须对微腔厚度及面积大小进行分析与论证,以满足成像和统计学的要求。2、光学成像系统设计。针对样本特性设计了多模态光路成像光学系统,实现单粒子的侧向散射光、前向散射光和荧光成像功能,省去传统流式细胞术中的精细的液路结构、高灵敏度的检测器和复杂的光电检测系统。重点介绍了成像光路结构以及光源波长选择,设计微球模拟实验,验证前向散射光的均匀性和对不同尺寸的微小细胞区分的可行性。3、白细胞分类检测图像处理算法。首先细胞图像分割以荧光图像为主要处理对象,使用边界跟踪算法提取细胞边界信息,对特殊的粘连细胞利用边界剥离算法将其分开,利用细胞位置信息定位并提取,前向散射图像和侧向散射图像中相应的细胞信息。其次是建立有效数据集,并利用该数据构建BP神经网络并对网络进行了训练与测试。4、系统性能评价研究。以Sysmex XE-5000血液分析仪为参照,设计实验,对白细胞分类系统的准确度、精密度等进行评价。本系统针对以上四个方面的研究,针对新鲜人体血液白细胞分类这一特定检测项目,提出一种基于微流控技术和多模态光学成像技术的白细胞分类检测系统,实现了关键技术突破,可为战场急救、灾害救援及基层医疗中的白细胞快速分类检测提供支持。结果:(1)在血液预处理操作中,将新鲜血液稀释三倍,取100μl,加入10μl NP-40和10μl吖啶橙,可得到最佳血液预处理效果。同时经计算模拟,微流控芯片的微腔厚度确定为100μm,面积为2mm×2mm,可较好的满足白细胞成像检测条件。(2)考虑吖啶橙荧光染色特性,荧光光源选择中心波长λ为480nm的激发光源;同时为了减少血液中血红蛋白对样本透光率的影响,最终散射光光源选择中心波长λ为650nm的激发光源。在FSC光路中,遮光片与透镜组合可有效阻止前向散射光光源进入到相机中,并且可以透过90%以上的细胞散射光。侧向散射光和荧光光源因为呈一定角度照射样本,不会直接进入到相机中,在荧光光路中采用下方照明的方式,降低因为血红蛋白透光率引起的对白细胞的成像影响。(3)BP神经网络训练测试结果里,除单核细胞以外,淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的训练集和测试集准确率均在90%以上,高于同类模式识别算法。但是对于单核细胞的处理,在成像方式、特征值提取等方面仍然需要进一步改善。(4)系统对白细胞总数计数中,利用Passing-Bablok回归模型分析,选取100例样本进行检测,实际测试表明,该系统与Sysmex XE-5000结果的比例差异为0.989,P0.05,二者检测结果具有一致性。WBC浓度3.0×10~9/L的重复性测试结果中,变异系数小于4.0%,优于同类型微流控细胞计数产品。系统线性评价实验中,得到检测结果与理论值线性拟合R~2=0.9996,偏差范围在±5%以内,证明系统线性检测结果可靠。白细胞四分类计数评价实验中,共选取40例血样进行系统分类检测,与Sysmex XE-5000设备检测结果进对比得出,淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的比例差异值都非常接近1(分别为0.949,0.953,1.077),系统差异值结果都非常接近0(分别为-0.312,0.648,0.002),P值均0.05,即为本系统测得的白细胞分类结果与Sysmex XE-5000设备的检测结果具有一致性;重复性实验中测试结果显示,嗜酸性粒细胞和单核细胞变异系数略大,嗜酸性粒细胞主要是因为在白细胞内占比很小,轻微的计数差异便可引起较大的变异系数,单核细胞则是因为其特征值信息与其它细胞特征值信息差别不明显,其他两类细胞变异系数结果较好,均小于6.5%。结论:课题研究成果为床旁检测、基层或边远地区、战场及自然灾害现场的白细胞快速检测分类、准确分析结果提供了有效的方法,实现了白细胞检测专用平台的关键技术突破,提出了白细胞分类检测系统性能评价方法,拓展了微流控芯片技术的应用领域,为POCT白细胞分类检测设备的研制提供了方法与实践参考。
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：O657.3;R446.1
【图文】：

重大事件,作业条件,应急救援,高寒地区

1.1 不同环境的作业条件（a）地震后应急救援环境（b）高寒地区（c）舰船潜艇内作业间（d）空间站II 国家层面：（1）重大事件现场应急医学救援的需求。近年来重大自然灾害大安全事故、公共卫生事件时有发生，如图 1.2（a）和 1.2（b）所示，应急情况下的白细胞分类检验设备可为救援工作者准确判断伤员病情和体征提供的诊断依据。同时，现场快速检验对于医疗设备的抗震性、多地形适应性、性、易操作性和快速准确性具有较高要求，目前医院使用的全自动血液分析

社区医院,抗震救灾,地质灾害,医疗器械

很大程度上依赖于基层卫生医疗保障，建设农村、乡镇居民公共卫生服务体，城市社区卫生服务站，深入推进公立医院转型是今后国内医疗改革的主要目，社区医院是其中建设的重要一环，如图 1.2（c）和 1.2（d）所示。目前医院泛使用的血液分析仪大多采用湿化学技术原理，造价昂贵，操作复杂，内部结精密且液路管道需经常清洗维护，设备配套液体耗材一般为上百人份用量，拆后短期必须用完，否则将过期失效，不适用于基层医疗中患者量不大的情况。OCT 设备的简单易操作性、价格低廉及检测快速准确等优点充分满足了基层医疗设的需求，适合在基层医疗卫生服务中大力推行[25 27]。（3）我国医疗器械发展的需求。与欧美先进发达国家相比，我国医疗器械的展还处于落后的状态，医疗器械与药品消费比例远低于发达国家，而医疗器械整个医疗体系中又占有非常重要的位置，他决定着医生对病人病情的诊断、治方案的确定及后续用药，因此我国医疗设备的发展空间还很大[28 30]。其次，随科技的发展和人们医疗保健需求的日渐提升，POCT 设备作为一种相对较新的医器械，以其价格低廉、小型化、傻瓜式自动检测等优势，在未来将会成为日常活中的一部分，成为远程诊疗服务、家庭健康管理的重要一环。

视图,视图,微腔,试剂

图 1.3 离心后毛细管血样分层放大视图图 1.4 QBC AutoRead PluseCue 公司在 2008 年生产了第一款可实现白细胞计数功 WBC System，并在该产品上市两年之后，通过改进图像成像原理可实现白细胞分类的检测设备 HemoCue WBC DIFF System。该设的主机和一次性的微流芯片组成，如图 1.5 所示，主机中包含微型显和 LCD 显示单元三部分。一次性芯片顶端微腔厚 120μm，可通过毛 10μl 血样，迅速与微腔内的干性溶血剂和染色试剂试剂均匀混合，到分析仪中可获取微腔中细胞图像，利用图像算法处理实现白细胞

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