呼吸道样本快速采集装置和基于杂交链式（HCR）反应的甲型流感病毒检测技术研究

发布时间：2020-08-04 09:59

【摘要】：作为一种常见的呼吸道传染病病原,甲型流感病毒会造成急性上呼吸道感染,可通过空气飞沫等途径迅速传播,一直以来严重威胁人类生命健康。因此,建立通用性甲型流感病毒的快速检测技术在甲型流感患者的早期筛查和诊疗方面具有重要意义,可为及时有效应对此类传染病疫情的爆发提供技术支持。目的:本课题立足于呼吸道传染病疫情频发严的现实背景,拟设计一种简便、易用、便携的管式呼(咳)出气收集装置,以满足上呼吸道传染病病原样本的快速收集目的。同时,利用纳米材料及等温扩增技术在传染病检测方面的优势,建立一种简便、准确、灵敏的甲型流感病毒检测方法,以解决现有检测方法中存在的采样操作复杂、样本背景干扰大、操作步骤冗繁,以及依赖大型仪器不利于实施现场检测的问题。方法:对目前已有的关于呼(咳)出气采集装置的相关报道、文献、专利及商品化产品进行调研。以上呼吸道传染病病原体采集为目标,基于气溶胶相变原理和受限空间流体运动规律,设计了一种管式呼(咳)出气采集装置。设计并构造该装置实物,并针对该装置分别对仪器降温速率、采集管降温速率、冷凝液收集量三个内容进行测定,以评价其工作效能。以甲型流感M1蛋白的特点序列设计HCR反应引物序列,并通过琼脂糖凝胶电泳实验对反应结果进行验证。随后,分别固定FAM基团修饰的H1、H2浓度、Itarget浓度优化氧化石墨烯(GO)的淬灭作用浓度和时间。接着以优化好的GO淬灭作用浓度和时间对HCR反应进行反应时间优化,确定最终的反应条件。最后依据优化后的反应检测条件,分别从单碱基错配识别能力、定量检测能力、甲型流感通用性检测能力及临床样本检测四个方面对该检测方法进行评估。结果:建立了气溶胶快速冷凝的呼(咳)出气采集装置,主要性能为:仪器制冷模块能够在开机10分钟内从28℃降温到-4℃内,具有降温速度快,温度工作稳定的特点;采集管温度在1分钟之内可由室温迅速降到2℃,具有良好的制冷效果;1分钟内的采集样本量可达200μL左右,满足后续检测用量。建立了基于HCR反应和GO淬灭荧光的甲型流感病毒检测方法,优化确定的HCR反应条件为:H1,H2各50nM,反应时长为2.5h,反应结束后以20μg/mL的GO对反应产物进行淬灭,荧光淬灭时长为30min;淬灭结束后检测荧光强度,激发波长480nm,发射波长520nm。实验结果表明,所建立的HCR检测方法能够特异甲型流感病毒(H1、H5、H7型),与乙型流感病毒、腺病毒的检测结果差异具有统计学意义(P0.01),I_(target)组荧光强度高于I_(mismatch)组(P0.05)表明该方法具有单碱基错配识别能力,该方法阳性检测范围为5-100nM,同时在10-40nM范围内荧光强度与目标检测物浓度表现出了良好的线性关系(y=4.7576x-10.401 R2=0.9858)。对15例鼻咽拭子的检测结果表明,所建立的HCR检测方法与Real time-PCR检测结果完全一致。结论:本研究研发了一种针对于上呼吸道传染病样本的管式呼(咳)出气采集装置,具有降温效率高、目标温度可控、小巧便携、易于操作等特点,可满足上呼吸道传染病样本快速采集需求,并为后续与生物传感检测设备的联用奠定了基础。此外,基于杂交链式(HCR)反应,利用氧化石墨烯对荧光基团的淬灭作用设计了一种通用型甲型流感病毒的快速检测方法。这种HCR扩增检测技术具备等温、无酶、反应体系简单、操作步骤简便等优点,表现出较好的样本检测能力,具有良好的现场检测应用前景。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R511.7;R440
【图文】：

管式呼（咳）出气收集装置主视图

管式呼（咳）出气收集装置左视图

图 1-3 管式呼（咳）出气收集装置俯视图模块：模块由制冷金属体（320），热防护层（321），制冷半），制冷控制电路（350），制冷风扇（300），制冷温度指示（331），8 个部分组成。

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 刘金钏;吕珍珍;陈爱亮;;适配体纳米金比色分析技术研究进展[J];光谱学与光谱分析;2014年08期

本文编号：2780389