基于微流控液滴的单细胞内多种miRNAs的定量检测及其用于相关疾病诊断的研究

发布时间：2020-08-04 12:56

【摘要】：细胞是生命结构和功能的基本单位,结构和功能多样化的细胞相互作用,共同构成复杂的生命体。生命体中的细胞由于功能的多样化,细胞间具有明显的异质性。这种差异往往在生命有机体的生长、分化和发育等过程中起到至关重要的作用。同样,在癌症的发展过程中,不同类型或者不同状态的肿瘤细胞由于其所处的生理环境的差异性及肿瘤的发展过程的差异性,肿瘤细胞内的遗传物质及生命活性物质都有很大的差异性。而miRNA作为重要的生物活性分子,广泛参与到生命活动的进程中去。尤其在肿瘤的发展过程中,与肿瘤发展相关的miRNA的含量会发生的相应的含量变化。在已有的研究成果中显示,可以通过miRNAs的含量的分布情况进行肿瘤细胞的分类和鉴定。如果能在疾病发生之初及时的检测并施以正确的治疗方案,可以达到早期诊断、防病于未然之中,具有非常重要的临床应用前景。然而,对于肿瘤的早期诊断来讲,能够在癌症早期进行相应的诊断方案非常少。循环肿瘤细胞是进行癌症早期评价的重要指标,但是血液中含量极低,很难进行基于传统手段群体细胞的检测和分析。单细胞分析是非常适用于循环肿瘤细胞检测和分析的手段。由于单细胞细胞内miRNAs的含量极低,传统的方案由于各种局限性很难实现单细胞内miRNAs的高灵敏检测。基于此,我们提出了一种基于微流控液滴的单细胞内miRNAs的高通量和高灵敏的检测方案,并利用该方案实现了单细胞内多种miRNAs的同时检测,并将该方法应用到肿瘤细胞的分类中去。本论文共三个部分,其中:第一章为绪论,首先介绍了单细胞分析在生命科学中的重要性,以及目前对于单细胞检测已有的主要的检测类型进行简单的概述;然后对miRNAs在生命科学中的功能和应用以及目前已有的单细胞内miRNAs的分析策略和方法进行了阐述。第二章为用于单细胞miRNA定量检测的微液滴系统的设计与构建。在该章中我们通过设计高通量的液滴生成芯片进行了高通量的稳定的液滴生成,并通过优化构建的微液滴系统进行高通量的单细胞操控,为单细胞的高通量检测提供了基础和依据。第三章为基于微流控液滴的单细胞内多种mi RNAs的定量检测及其用于肿瘤细胞的分类。我们发展了一种基于微流控液滴进行单细胞的高通量包裹,在液滴内进行miRNAs的二次等温信号扩增并用实验室自行搭建的激光诱导荧光检测装置进行液滴内荧光信号检测的方案。利用该分析方案进行了单细胞内miRNAs的高通量定量检测。通过对不同种类的细胞之间的miRNAs的含量进行测量并绘制其分布图谱,实现了不同种类癌症细胞基于miRNAs表达含量的不同进行分类。为单细胞内miRNAs的高通分析及细胞类型的分类提供了一种新的方法。
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R440
【图文】：

图 1-1 单细胞分析中常见的分析手段[7]。A）毛细管电泳—激光诱导荧光检测方案实现待测组分的分离并研究单细胞的胞吐；b) 利用基于光纤维的纳米生物传感器进行单个细胞外乳酸的荧光检测；c) 利用电分析法研究受刺激后的单个细胞的胞吐；d) 基于质谱的方法进行单细胞的代谢组分分析。1.2.1 基于分离的单细胞分析基于分离的单细胞分析技术在单细胞的发展过程中起到非常重要的作用，已经被用来进行单细胞胞吐的研究。但是仅仅依靠传统的分离技术很难实现单细胞胞吐的研究。由于单细胞的体积小，大约在皮升数量级[8，9]。那么在进行单细胞分析时，需要高效、低样品消耗量且灵敏度高的检测手段，才能解决检测单细胞体积小、待测组分含量低的问题。在此，毛细管电泳相比于传统的分离局势（液相色谱、气相色谱等）具有更好的质量灵敏度[10，11]。毛细管电泳依靠带电分子在

图 1-2 微流控芯片的详细部分的通道布局和图像[19]，用于监测 15 个独立胰岛细胞的胰岛素分泌。(A)整个设备的通道网络。微流体通道由实心黑线表示，圆形代表流体储存室。每一种类型的流体储存室(持有不同的溶液)都用不同的颜色来表示清楚。(B)一个胰岛细胞灌注室的侧视图表示(不按比例)。胰岛被加载到带有生理缓冲的胰岛室，然后在立体显微镜下用 PDMS 塞密封。灌注缓冲液流过整个胰岛室，并将所有分泌的胰岛素推入取样通道。(C)剪切流分离的 CCD 成像，允许快速流动的胰岛素样流与驱动型免疫测定试剂的慢流兼容。箭头表示流向和估计的流量大小。(D) CCD 相机拍摄区域的明场图像。从 15 个分离通道流出，进入芯片的中心部分，然后通过一个单一的废液通道流出(照片的底部中心)。本系统应用于 AtT-20 细胞的神经节苷脂代谢分析。细胞与荧光染料四甲基罗丹明(TMR)-GM1 孵育，并产生了一系列具有荧光标记的代谢物。使用毛细管电泳分离组分和激光诱导荧光装置进行检测，他们能够在单细胞水平进行代谢分析。

液滴的单细胞内多种 miRNAs 的定量检测及其用于相关疾病细胞含量稀少的待测物来说具有减少扩散。可以保护单细胞内待测的活性物质的活性，单细胞的隔离，在单细胞的分析上具有明显的展了一种微液滴内进行PCR扩增方法用于单细胞被破膜后，胞内的 miRNA 可诱发两条物 DNA 作为 PCR 模板被单分子封装在两万过计数发出荧光的液滴数目可实现单细胞内目分析是一种在循环肿瘤细胞分析中常用到的的含量极少，可利用微流控芯片从样品中高效，后续对其进行基因分析。

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本文编号：2780576