【摘要】：细菌性痢疾(简称菌痢)是以志贺菌侵袭结肠粘膜,上皮细胞炎症渗出为特征的肠道急性传染病,其在世界各地都有流行,是全球重要的公共卫生问题。氨苄西林作为广谱抗生素,在禽畜养殖业中广泛应用于治疗肠杆菌科细菌感染。由于氨苄西林持续广泛使用及滥用,导致志贺菌属细菌对其耐药性增强,在“One Health”(同一健康)的理论下,耐药菌会传播到人类,严重威胁人类健康安全。目前对于治疗细菌性痢疾失败的原因主要归因于耐药。然而志贺菌对抗生素耐受同样也会导致抗生素治疗感染性疾病的失败。关于志贺菌对氨苄西林耐受的基因水平机制的研究尚不明确,本文将通过体外诱导的方法获得耐受株,运用全基因组测序的方法分析志贺菌株对氨苄西林耐受的相关机制,为控制志贺菌对抗生素耐药提供理论基础。目的通过体外诱导的方法获得志贺菌对氨苄西林的耐受株,探讨志贺菌对氨苄西林耐受形成的特点及分子机制。方法1.对2014年分离于河南省睢县腹泻患者粪便样本中的细菌进行生化和血清学鉴定,运用K-B纸片扩散法筛选对氨苄西林敏感的菌株。2.采用微量肉汤稀释法测定对氨苄西林敏感株的最低抑菌浓度(MIC),用10MIC氨苄西林抗生素浓度间隔诱导志贺菌,测定其耐受评价指标MDK99。3.原代志贺菌株mel-ss2014011以及诱导菌株mel-ss2014011-10做全基因组测序,对诱导菌株mel-ss2014011-20做重测序,筛选与耐受相关的基因以及non-SNPs以及Indels。4.RT-PCR检测发生non-SNPs的相关基因的表达水平。结果1.经过生化及血清学鉴定分离出1株对氨苄西林敏感宋内志贺菌,命名为:mel-ss2014011。2.原代志贺菌株对氨苄西林的MIC为2μg/ml,经氨苄西林间隔诱导后,诱导菌株mel-ss2014011-10及mel-ss2014011-20的MIC保持不变,仍然为2μg/ml,而原代菌株的细菌浓度从6.5×1010 CFU/ml降低为2.9×108 CFU/ml的时间为10 min(即:MDK99为10 min),诱导菌株mel-ss2014011-10的细菌浓度从6.5×1010 CFU/ml降低为1.85×108 CFU/ml的时间为40 min(即:MDK99为40 min)。说明菌株已经耐受,而mel-ss2014011-20株的细菌浓度的从2.8×109 CFU/ml降至5×107 CFU/ml的时间超过10h(即:MDK99超过10h)。3.全基因组测序结果显示,原代株mel-ss2014011特有基因在KEGG数据库有对应的基因名称共29个,这些基因在COG功能数据库中除了GL000514基因的功能未知外,其余基因的功能主要集中在能源生产和转换,翻译,核糖体结构和生物发生,细胞内运输,分泌和囊泡运输,碳水化合物转运和代谢,以及防御机制。mel-ss2014011-10特有基因在KEGG数据库有对应的基因名称共4个,除了11-10GL002198基因的功能在COG功能数据库未知外,其余基因的功能主要集中在翻译,核糖体结构和生物发生。重测序结果表明,与mel-ss2014011相比,mel-ss2014011-10无SNP结果,而mel-ss2014011-20具有1个非同义突变。在KEGG数据库中对GL002314基因名的注释是cfa,编码环丙烷脂肪酰基磷脂合成酶。与mel-ss2014011相比,mel-ss2014011-10有5个插入,1个缺失,其中位于编码区的有2个,与mel-ss2014011相比,mel-ss2014011-20有39个插入,1个缺失,其中位于编码区的有23个,而与mel-ss2014011比,mel-ss2014011-10以及melss2014011-20共有Indel为1个,即:GL004657基因,该基因编码的产物为转座酶,在COG中的分类为X,该基因在ARDB耐药数据库中无解释,此转座酶并无携带有耐药基因。4.RT-PCR结果显示,mel-ss2014011,mel-ss2014011-10,mel-ss2014011-20中cfa基因的相对表达水平分别为1±0.14,2.81±0.24,7.56±0.90。方差分析显示野生型和诱导菌株的表达差异显著(F=118.87,P0.001)。差异有统计学意义,LSD-t检验结果显示两两之间差异均有统计学意义。结论1.在氨苄西林的间隔诱导下,志贺菌可以发生耐受。在氨苄西林诱导志贺菌的20个循环内,循环数越大,其MDK99值越大。2.与原代株相比,诱导株mel-ss2014011-10比原代株少了29个基因,多了4个基因,这些基因的功能主要集中在能源生产和转换,翻译,核糖体结构和生物发生,细胞内运输,分泌和囊泡运输,碳水化合物转运和代谢,以及防御机制。它们可能与志贺菌耐受相关。3.志贺菌对氨苄西林耐受可能与cfa基因有关,其表达量的升高,促使细菌对抗生素产生耐受。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R446.5
【图文】：
头孢西丁 FOX 30≤14 15-17 ≥18头孢哌酮 CFP 32≤15 16-20 ≥21头孢噻肟 CTX34≤22 23-25≥26头孢他叮 CAZ 32 ≤17 18-20 ≥21头孢唑林 CZO 28 ≤19 20-22 ≥23氨曲南 AZT 32 ≤17 18-20 ≥21环丙沙星 CIP 24 ≤15 16-20 ≥21四环素 TCY 24 ≤11 12-14 ≥15头孢呋辛 CXM 25 ≤14 15-17 ≥18左氧氟沙星 LVX 20 ≤13 14-16 ≥17妥布霉素 TOB 15 ≤12 13-14 ≥15亚胺培南 IMP 30 ≤19 20-22 ≥23氨苄西林 AMP 24 ≤13 14-16 ≥17头孢曲松 CRO 35 ≤19 20-22 ≥23美罗培南 MEM 35 ≤19 20-22 ≥23阿莫西林/棒酸 AMC 24 ≤13 14-17 ≥18
U/ml 降至 0，而 mel-ss2014011-20 株的细菌浓度从 2.8×109CFU/ml 降至 5×107CFU/ml 超过 10h（即：MDK99超过 10 h）（图3.2）。无抗对照菌株与原代株的 MIC 和 MDK99一致，表明在抗生素压力下会产生志贺菌耐受性（图 3.1 和图 3.2）。
图 3.3 mel-ss2014011 的碱基和质量分布图注：（A）图为碱基分布图，（B）图为质量分布图图 3.4 mel-ss2014011-10 的碱基和质量分布图注：（A）图为碱基分布图，（B）图为质量分布图
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2786897
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