具有高效降解地塞米松能力的伯克霍尔德菌CQ001株的分离及功能基因组学分析
发布时间：2020-08-11 16:53
【摘要】：目的研究细菌对地塞米松类甾体激素的降解作用及其分子机制,为构建清除水环境医源性地塞米松类药物污染的工程菌奠定基础。方法采用富集培养法从医院废水中分离降解地塞米松的细菌,采用固相萃取-高效液相色谱(HPLC)法检测细菌对地塞米松的降解效能,通过16S r DNA序列测定进行鉴定。用Illumina Hiseq4000结合第三代测序技术对降解菌的全基因组测序,并进行序列组装、注释和分析,对降解地塞米松相关基因进行RT-q PCR验证。结果分离到1株对地塞米松有较高降解作用的细菌,经鉴定属于伯克霍尔德菌属(Burkholderia),命名为Burkholderia sp.CQ001。该菌对地塞米松磷酸钠及地塞米松的降解率分别为84.8%和77.11%。全基因组测序表明Burkholderia sp.CQ001包含2条染色体和4个巨型质粒,与代谢相关基因大部分集中在2号染色体上,共3 260 157 bp。生物信息学分析表明,该菌含有甾体代谢通路中许多重要酶类的编码基因,其中与地塞米松降解相关的有ABC转运子,3-甾酮-9α-脱氢酶等,这些基因在以地塞米松磷酸钠为碳源的培养条件下表达量不同程度地高于以蔗糖为碳源的培养条件。结论 Burkholderia sp.CQ001是一株具有强大的代谢功能和代谢途径丰富的细菌,具有降解地塞米松类甾体激素的性能,该菌株为后续研究甾体激素的降解机制和构建清除水环境医源性地塞米松类药物污染的工程菌提供了菌种。
【图文】：
TCACTGCGGCTCGAACACKshB1正义ATGAGCGATTCGCGCTTC反义TCAGTCGGGAAACACCACGKshB2正义GTGGACAGCCGGGTCAC反义CTACTTGTCGATCACGAGATCCABC正义ATGGAAAACAAATCACATGCGTTC反义TCACTGCCCGGCCGTCG2结果2．1地塞米松降解菌的分离和鉴定从医院废水中分离到一株能降解地塞米松磷酸钠和地塞米松的细菌，该菌在在LB琼脂平板上形成中等大小(d=1．52．0mm)、圆形、表面光滑湿润、边缘整齐、易挑起的浅黄色不透明菌落。涂片革兰染色后油镜下观察为革兰阴性杆菌，菌体呈直的或略为弯曲的杆状，(6～15)μm×(4～15)μm大小(图1)。经16srDNA序列鉴定，初步确定该菌属于伯克霍尔德菌属(Burk-holderia)，命名为Burkholderiasp．CQ001。通过系统进化树构建发现，在物种进化水平上，该菌株的16SrRNA序列与BurkholderiacontaminansJ2956的同源性最高。A:革兰染色×1000;B:扫描电镜×4000图1分离菌的菌落特征、形态和染色性2．2Burkholderiasp．CQ001对地塞米松的降解特性通过HPLC检测发现Burkholderiasp．CQ001能将地塞米松磷酸钠先降解为地塞米松后再将地塞米松降解为其他物质，在pH7．5的地塞米松磷酸钠培养液中，37℃震荡培养约24h出现降解高峰，对地塞米松磷酸钠及地塞米松的总降解率分别为84．8%和77.11%(图2)。1354第三军医大学学报，2017，39(13)http://aammt．tmmu．edu．cn
图2Burkholderiasp．CQ001对地塞米松磷酸钠和地塞米松的降解曲线2．3Burkholderiasp．CQ001全基因组测序结果Burkholderiasp．CQ001全基因组测序结果已上传至GenBank，登录号为PRJNA329146。该菌株包含2条染色体和4个巨型质粒，1号染色体基因组全长3735298bp，2号染色体基因组全长3260157bp。4个巨型质粒的基因组长度分别为1537783bp，385838bp，97411bp，2873bp。基因组结果的信息统计见表2所示。其全基因组序列与Burkholderiaviet-namiensisG4的亲缘关系最为接近。与代谢相关基因大部分集中在2号染色体上。根据所测基因序列绘制2号染色体的基因组模式图(图3)，其中，第1圈和第2圈为正链、负链上的CDS，不同的颜色表示不同的COG功能分类;第3圈为rRNA和tRNA;第四圈为GC含量;最内1圈为GCskew值。表2菌株CQ001基因组基本信息统计表基因组信息数据基因数目8758基因总长度7660596bp基因平均长度874bp基因密度0．971基因/kb基因区域GC含量(%)66．9基因/基因组(%)84．9属间区域长度1358764bp属间区域GC含量(%)61．0属间长度/基因组(%)15．12．4Burkholderiasp．CQ001的基因功能注释和分类将Burkholderiasp．CQ001基因组中与代谢相关的8758个编码基因与数据库blaste比对后获得COG、GO、KEGG基因功能注释(图4)。在与COG数据库比对后，有69．8%的编码基因得到功能分类(图4A)，其中，与能量产生和转换(C)相关的基因有408个，与碳水化合物转运和代谢(G)相关的基因有396个，与次生代谢产物合成、运输和分解(Q)相关的基因262个。与KEGG数据库比对分析表明(图4C)，在该菌可进行的117条代谢通路中，涉及一条甾体代谢通路(图5)，其中含有8个与编码甾类化合物代谢相关的摄取转运蛋白和5种降解关键酶的基因(表3)。以上分析表明Bu
类(图4A)，其中，与能量产生和转换(C)相关的基因有408个，与碳水化合物转运和代谢(G)相关的基因有396个，与次生代谢产物合成、运输和分解(Q)相关的基因262个。与KEGG数据库比对分析表明(图4C)，在该菌可进行的117条代谢通路中，涉及一条甾体代谢通路(图5)，其中含有8个与编码甾类化合物代谢相关的摄取转运蛋白和5种降解关键酶的基因(表3)。以上分析表明Burkholderiasp．CQ001是一株具有强大的代谢功能和代谢途径丰富的细菌，可为进一步研究细菌对甾类化合物的降解机制和开发具有应用价值的工程菌提供丰富的资源。图3Burkholderiasp．CQ001的2号染色体基因组模式图2．5地塞米松降解相关基因的功能验证从Burkholderiasp．CQ001基因组中筛选出的可能与降解甾类化合物相关的部分关键基因，根据相关文献阐述的甾体多步降解反应的发生机制［10，13－14］，结合地塞米松的化学结构，推测该菌株在降解地塞米松的过程中，其甾核开环可能仅仅涉及KSH这一双组分酶的作用。用RT-qPCR检测可能涉及地塞米松降解相关基因的表达变化，结果显示，在以地塞米松磷酸钠为碳源的条件下培养24h，ABC转运子，KshA，KshB表达量不同程度地高于以蔗糖为碳源的培养条件，其中，ABC转运子的增高最为显著，增加20．53倍(图6)。表明这些基因的表达均参与了地塞米松的降解，推测KshA及KshB1应属于地塞米松强烈诱导型加氧酶及还原酶，而KshB2对地塞米松的刺激没有B1敏感，这可能与KstR2的调控机制有关［15］。http://aammt．tmmu．edu．cn第三军医大学学报，2017，39(13)1355
本文编号：2789323
【图文】：
TCACTGCGGCTCGAACACKshB1正义ATGAGCGATTCGCGCTTC反义TCAGTCGGGAAACACCACGKshB2正义GTGGACAGCCGGGTCAC反义CTACTTGTCGATCACGAGATCCABC正义ATGGAAAACAAATCACATGCGTTC反义TCACTGCCCGGCCGTCG2结果2．1地塞米松降解菌的分离和鉴定从医院废水中分离到一株能降解地塞米松磷酸钠和地塞米松的细菌，该菌在在LB琼脂平板上形成中等大小(d=1．52．0mm)、圆形、表面光滑湿润、边缘整齐、易挑起的浅黄色不透明菌落。涂片革兰染色后油镜下观察为革兰阴性杆菌，菌体呈直的或略为弯曲的杆状，(6～15)μm×(4～15)μm大小(图1)。经16srDNA序列鉴定，初步确定该菌属于伯克霍尔德菌属(Burk-holderia)，命名为Burkholderiasp．CQ001。通过系统进化树构建发现，在物种进化水平上，该菌株的16SrRNA序列与BurkholderiacontaminansJ2956的同源性最高。A:革兰染色×1000;B:扫描电镜×4000图1分离菌的菌落特征、形态和染色性2．2Burkholderiasp．CQ001对地塞米松的降解特性通过HPLC检测发现Burkholderiasp．CQ001能将地塞米松磷酸钠先降解为地塞米松后再将地塞米松降解为其他物质，在pH7．5的地塞米松磷酸钠培养液中，37℃震荡培养约24h出现降解高峰，对地塞米松磷酸钠及地塞米松的总降解率分别为84．8%和77.11%(图2)。1354第三军医大学学报，2017，39(13)http://aammt．tmmu．edu．cn
图2Burkholderiasp．CQ001对地塞米松磷酸钠和地塞米松的降解曲线2．3Burkholderiasp．CQ001全基因组测序结果Burkholderiasp．CQ001全基因组测序结果已上传至GenBank，登录号为PRJNA329146。该菌株包含2条染色体和4个巨型质粒，1号染色体基因组全长3735298bp，2号染色体基因组全长3260157bp。4个巨型质粒的基因组长度分别为1537783bp，385838bp，97411bp，2873bp。基因组结果的信息统计见表2所示。其全基因组序列与Burkholderiaviet-namiensisG4的亲缘关系最为接近。与代谢相关基因大部分集中在2号染色体上。根据所测基因序列绘制2号染色体的基因组模式图(图3)，其中，第1圈和第2圈为正链、负链上的CDS，不同的颜色表示不同的COG功能分类;第3圈为rRNA和tRNA;第四圈为GC含量;最内1圈为GCskew值。表2菌株CQ001基因组基本信息统计表基因组信息数据基因数目8758基因总长度7660596bp基因平均长度874bp基因密度0．971基因/kb基因区域GC含量(%)66．9基因/基因组(%)84．9属间区域长度1358764bp属间区域GC含量(%)61．0属间长度/基因组(%)15．12．4Burkholderiasp．CQ001的基因功能注释和分类将Burkholderiasp．CQ001基因组中与代谢相关的8758个编码基因与数据库blaste比对后获得COG、GO、KEGG基因功能注释(图4)。在与COG数据库比对后，有69．8%的编码基因得到功能分类(图4A)，其中，与能量产生和转换(C)相关的基因有408个，与碳水化合物转运和代谢(G)相关的基因有396个，与次生代谢产物合成、运输和分解(Q)相关的基因262个。与KEGG数据库比对分析表明(图4C)，在该菌可进行的117条代谢通路中，涉及一条甾体代谢通路(图5)，其中含有8个与编码甾类化合物代谢相关的摄取转运蛋白和5种降解关键酶的基因(表3)。以上分析表明Bu
类(图4A)，其中，与能量产生和转换(C)相关的基因有408个，与碳水化合物转运和代谢(G)相关的基因有396个，与次生代谢产物合成、运输和分解(Q)相关的基因262个。与KEGG数据库比对分析表明(图4C)，在该菌可进行的117条代谢通路中，涉及一条甾体代谢通路(图5)，其中含有8个与编码甾类化合物代谢相关的摄取转运蛋白和5种降解关键酶的基因(表3)。以上分析表明Burkholderiasp．CQ001是一株具有强大的代谢功能和代谢途径丰富的细菌，可为进一步研究细菌对甾类化合物的降解机制和开发具有应用价值的工程菌提供丰富的资源。图3Burkholderiasp．CQ001的2号染色体基因组模式图2．5地塞米松降解相关基因的功能验证从Burkholderiasp．CQ001基因组中筛选出的可能与降解甾类化合物相关的部分关键基因，根据相关文献阐述的甾体多步降解反应的发生机制［10，13－14］，结合地塞米松的化学结构，推测该菌株在降解地塞米松的过程中，其甾核开环可能仅仅涉及KSH这一双组分酶的作用。用RT-qPCR检测可能涉及地塞米松降解相关基因的表达变化，结果显示，在以地塞米松磷酸钠为碳源的条件下培养24h，ABC转运子，KshA，KshB表达量不同程度地高于以蔗糖为碳源的培养条件，其中，ABC转运子的增高最为显著，增加20．53倍(图6)。表明这些基因的表达均参与了地塞米松的降解，推测KshA及KshB1应属于地塞米松强烈诱导型加氧酶及还原酶，而KshB2对地塞米松的刺激没有B1敏感，这可能与KstR2的调控机制有关［15］。http://aammt．tmmu．edu．cn第三军医大学学报，2017，39(13)1355
本文编号：2789323
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