浙江省感染性腹泻患者来源的气单胞菌流行特征、毒力基因与耐药性研究

发布时间：2020-08-11 17:35

【摘要】：研究背景及目的腹泻是全球重要公共卫生问题,大多由被污染的食物和水源造成。由细菌、病毒和寄生虫引起的感染性腹泻,是发展中国家普遍存在的问题。中国是感染性腹泻负担较高的国家之一。2017年,我国共报告感染性腹泻发病1471990例,其中丙类传染病(除霍乱、细菌性和阿米巴性痢疾、伤寒和副伤寒以外的感染性腹泻)发病1284644例,远超过甲乙类肠道传染病病例,可见对其他病原的检测是十分必要的。但目前国内临床实验室对腹泻病原菌的检测主要为霍乱弧菌、沙门菌和志贺菌等甲乙类传染病病原,却忽略了对其他病原的检测。气单胞菌(Aeromonas)是一类兼性厌氧、无芽孢、氧化酶阳性的革兰阴性杆菌,在自然界生态环境中广泛存在,尤其是水环境中。1961年人类首次从粪便当中分离到气单胞菌,此后普遍被视为引起腹泻的肠道致病菌。因临床上对气单胞菌缺乏重视,目前国内关于气单胞菌流行、毒力特征和耐药情况的资料较为缺乏。浙江省地处沿海,有较长的海岸线和丰沛的水资源,夏季温暖湿润的气候极有利于气单胞菌的生长,增加了感染的潜在风险。本研究收集了 2010年1月至2017年12月浙江省5家医院急性腹泻患者的粪便标本,进行病原学检测,以阐明气单胞菌的流行现状,为临床上科学地开展气单胞菌的常规检测提供依据;通过毒力基因的检测明确气单胞菌的毒力特征,为致病机制的研究奠定基础;通过药敏试验获得腹泻患者气单胞菌的耐药谱,为临床气单胞菌相关性腹泻的治疗提供依据。方法2010年1月至2017年12月,从我国浙江地区5家合作医院收集急性腹泻患者的粪便标本。用常规微生物检验程序结合MALDI-TOF质谱鉴定对粪便标本中常见肠道致病菌进行分离培养及鉴定。用PCR方法和纸片扩散法(K-B法)分别对分离的气单胞菌菌株进行毒力基因检测和药物敏感性试验。收集患者病例资料,分析气单胞菌相关性腹泻病例的临床特征。结果1.2010年1月至2017年12月,共纳入符合急性腹泻定义的病例25853例。检出率居前三位的细菌性病原为致泻性大肠埃希菌(23.02%)、副溶血弧菌(7.05%)和气单胞菌(5.10%)。2.在8747例进行了气单胞菌的培养及鉴定的病例中,男性与女性的检出率无统计学差异(P0.05);不同年龄组的检出率存在统计学差异(P0.001),以60岁以上老年人群最高,为6.70%;不同季节的检出率差异也具有统计学意义(P0.001),夏季(6-8月)最高,为6.02%。3.粪便中仅分离到气单胞菌的腹泻病例占67.66%,在临床上可出现腹痛(58.3%),呕吐(19.3%)和发热(12.9%)的症状。粪便主要为烂糊便(45.83%),其次为水样便(29.69%)。分离到气单胞菌混合其他病原的病例占32.34%,主要合并致泻性大肠埃希菌(40例,11.98%)、副溶血弧菌(27例,8.08%)和类志贺邻单胞菌(16例,4.79%)。4.636例气单胞菌阳性患者粪便标本中共分离到688株气单胞菌,其中587例仅分离到一种气单胞菌,46例分离到两种气单胞菌,3例分离到三种气单胞菌。587株单一分离的气单胞菌包括9个菌种,其中以维氏气单胞菌(194株,28.20%)和豚鼠气单胞菌(182株,26.45%)为主。5.688株气单胞菌中,97.5%的气单胞菌携带至少一种毒力基因。gcaT、fla、alt、acg、ela、act和lip在气单胞菌中的检出率较高(37%);aexT、lafA、tapA、ompAII、ahp和aaopH在气单胞菌中的检出率较低(8%);多数毒力基因在嗜水、豚鼠和维氏三种气单胞菌中的检出率存在显著性差异(P0.05)。6.气单胞菌对除外头孢西丁(63.37%)、四环素(61.63%)和亚胺培南(60.47%)的其他抗菌药物的敏感性大于79%;对17种抗菌药物的耐药率均在27%以下;而对作为腹泻治疗一线药物的喹诺酮类药物的敏感性(85%)、中介敏感性(10%)和耐药性(5%)均较理想。气单胞菌对多数抗菌药物的耐药性在嗜水、豚鼠和维氏气单胞菌这三个菌种间存在显著性差异(P0.05)。结论1.气单胞菌检出率位列细菌性病原的第三位,建议将气单胞菌纳入夏秋季节腹泻病原常规检测。2.气单胞菌不同菌种的毒力基因携带和耐药性存在差异,临床需区别对待。3.气单胞菌对喹诺酮类药物敏感性高,可作为临床首选。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R574.62;R446.5
【图文】：

浙江大学硕士学位论文逦正文实验方法逡逑３．４．２分离培养逡逑在装有标本的Ｃａｒｒｙ－Ｂｌａｉｒ培养基中，沾取棉签标本，直接划线接种血平板、逡逑麦康凯平板，３６±１°Ｃ培养１６？１８小时。再将棉签置ＡＰＷ培养基管中，放３６士逡逑１°Ｃ增菌１２小时。取增菌后ＡＰＷ液接种庆大琼脂平板和麦康凯平板，３６土１°Ｃ培逡逑养１６？１８小时。逡逑３．４．３菌落形态鉴定逡逑气单胞菌在麦康凯平板上菌落均呈中等大小、湿润且无色半透明，在庆大琼逡逑脂平板上呈黑褐色、不透明菌落，而在血平板上为中等大小、灰白色、光滑湿润逡逑突起、不透明的菌落，大多数具有溶血现象。逡逑

．分逦ＷＲ逦体积（（ｉｌ）逡逑邋ｘ邋Ｔａｑ邋Ｍａｓｔｅｒ邋Ｍｉｘ邋（Ｄｙｅ邋Ｐｌｕｓ）逦１２．５逡逑游引物逦１０）ｉＭ逦１．０逡逑游引物逦１0ｈＭ逦１．０逡逑ＮＡ邋模板逦５０－１００ｎｇ／Ｖｌ逦１．０逡逑ｄＨ２０逦９．５逡逑体积逦２５逡逑）逦ＰＣＲ扩增条件：预变性９４°Ｃ５ｍｉｎ；变性９４°Ｃ邋３０ｓ，退火温度３０ｓ，延伸０００ｂｐ／ｍｉｎ，３５邋个循环；最后邋７２邋°Ｃ邋延伸邋５ｍｉｎ。逡逑）核酸凝胶电泳：取印１ＰＣＲ产物，在１．５％的琼脂糖凝胶中进行电泳，电压泳时间为２邋５邋ｍｉ邋ｎ，凝胶成像系统拍照后分析结果。逡逑

序验证与结果分析：各毒力基因随机选取１株ＰＣＲ阳性产物送至上海程股份有限公司进行序列测定，引物自带。测序结果经美国国家生物心／局部序列比对基本检索工具（Ｎａｔｉｏｎａｌ邋Ｃｅｎｔｅｒ邋ｆｏｒ邋Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌａｔｉｏｎ邋／Ｂａｓｉｃ邋Ｌｏｃａｌ邋Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ邋Ｓｅａｒｃｈ邋Ｔｏｏｌ，邋ＮＣＢＩ邋／ＢＬＡＳＴ邋）比对确认。逡逑气单胞菌药敏试验逡逑分离到的气单胞菌菌株统一采用纸片扩散法（Ｋｉｒｂｙ－Ｂａｕｅｒ）做体外药物，药敏纸片规格和对敏感、中介、耐药的解释标准参照美国临床与实员会ＣＬＳＩ推荐的标准（ＣＬＳＩ邋Ｍ４５－Ａ３）［２６］，见表３。逡逑

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本文编号：2789358