蛋白质健康标志物准确定量方法研究

发布时间：2020-08-17 21:05

【摘要】：本研究以蛋白质健康标志物准确定量为目的,将蛋白质定量问题归为总蛋白定量、无需考虑活性的特定靶标蛋白定量及活性靶标蛋白定量三类,分别提出解决方案,较为系统的形成了蛋白质健康标志物准确定量方法体系。首先,针对由不同蛋白质混合物作为健康标志物的定量体系,以血清总蛋白测定为例,采用国际公认参考方法进行准确定量。国际临床化学和实验室医学联盟(IFCC)将双缩脲法作为血清总蛋白浓度测定的参考方法,其本身具有操作简单、抗干扰能力强、准确性高等优点。但即使在实验参数以及实验流程都被严格规定的情况下,不同实验室得出的实验数据仍然可能存在较大差异。因此,如何严格的执行参考方法获得准确、可靠的结果具有重要意义。本研究通过对参考方法中各参数进行校准、建立计量溯源性来保证参考方法被准确、严格的执行。在实验过程中,按照参考方法对各参数的要求,使用滤光片标准物质(GBW(E)130225、GBW(E)130226)逐一对实验中使用的紫外-可见分光光度计波长、吸光度进行校准,使用纯水称重法对移液器进行校准;使用蛋白标准品牛血清白蛋白(SRM927)作为血清总蛋白含量溯源依据,以蛋白标准物质牛血清白蛋白(BW3627-1)和冻干人血清白蛋白(GBW09187)作为样品,对双缩脲法的准确性、重复性、再现性、检出限、定量限等方法学数据进行了评价,从而建立准确可靠的血清总蛋白定量方法。并对国际参考实验室室间质量评价活动(RELA)的国际对比血清样品A、B进行了定量测定和不确定度评价。国际比对反馈的结果表明,我们的结果和其它实验室具有很好的一致性,表明了测定方法的准确以及测定技术的可靠性。其次,针对由无需考虑活性的单一蛋白健康标志物的准确定量问题,以血清中人心脂肪酸结合蛋白(H-FABP)测定为例,采用同位素稀释质谱法进行准确定量。心肌脂肪酸结合蛋白作为心肌损伤标志物的一种,对其进行准确定量对于心血管疾病诊断治疗具有重要意义。采用质量平衡法和同位素稀释质谱法对心肌脂肪酸结合蛋白进行了纯品含量测定,测定结果分别为0.795 g/g和0.781 g/g,并对同位素稀释质谱方法的准确性、重复性、不确定度等方法学参数进行了评价。最后,建立了血清中心肌脂肪酸结合蛋白的同位素稀释质谱测定方法,测定结果为2.56 ng/g,与ELISA试剂盒的测定结果2.34 ng/g具有良好的一致性,同时对该方法的准确性、重复性、加标回收率、检出限以及定量限进行了评价。心肌脂肪酸结合蛋白纯品同位素稀释质谱方法以及血清中心肌脂肪酸结合蛋白同位素稀释质谱方法都可以溯源到SI单位,可以作为心肌脂肪酸结合蛋白纯品标准物质、血清中心肌脂肪酸结合蛋白标准物质的测定方法,对于心肌脂肪酸结合蛋白的测定准确性、互通性具有重要意义。最后,针对活性靶标蛋白定量问题,以大豆转基因G2蛋白为例,采用PCR蛋白定量方法进行定量。现今大部分蛋白质的检测方法都需要标准品做标准曲线来进行相对定量,因而无法对活性靶标蛋白进行准确的绝对定量。利用抗原抗体的特异性结合来捕捉活性靶标蛋白质,再利用数字PCR仪作为测定仪器,就可以实现对蛋白质活性靶标蛋白浓度的绝对定量。基于以上设想,在荧光PCR以及数字PCR上进行了蛋白质的相对定量实验以保证绝对定量方法的可行性。本文使用大豆转基因G2蛋白以及G2蛋白的两个不同结合位点的单抗mbA1、mbA2为基础,使用TaqMan(?)蛋白系列试剂盒成功地建立了荧光PCR G2蛋白定量方法以及数字PCR G2蛋白定量方法。并使用G2蛋白标准物质为检测样品,对两种方法的准确性、重复性、再现性、检出限以及定量限进行了评价。并把两种方法的方法学参数和所建立的ELISA法的方法学参数进行了对比,结果表明PCR蛋白定量方法具有较高的准确性和重复性。同时,数字PCRG2蛋白定量方法由于其使用仪器为数字PCR,其结果的准确性和稳定性要比荧光PCR G2蛋白定量法的结果好。另外,由于数字PCR仪能直接给出样品的拷贝数而不依赖于标准曲线,所以对数字PCR蛋白定量方法进行了G2蛋白活性靶标蛋白浓度的绝对定量探究。
【学位授予单位】：北京化工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ937;R446.1
【图文】：

原理图,原理图,酒石酸,双缩脲反应

用紫外－可见光分光光度计测定双缩脲反应前后溶液在波长５４０邋ｎｍ处的吸光度逡逑值。为了准确的得到双缩脲反应前后的吸光度值变化，需要测定四个吸光度值并逡逑且用于之后样品总蛋白浓度的计算。实验原理如图２－１所示，吸光度值Ａ１为碱逡逑性酒石酸的空白，测定的是碱性酒石酸在波长５４０邋ｎｍ处的吸光度值；吸光度值逡逑Ａ２为测定碱性酒石酸溶液加入与反应组等量的血清样品后在波长５４０邋ｎｍ处的逡逑吸光度值；则Ａ２－Ａ１为样品空白。吸光度值Ａ３为试剂空白，测定的是双缩脲试逡逑剂加入与反应组等量的超纯水后在波长５４０邋ｎｍ处的吸光度值；吸光度值Ａ４为逡逑１３逡逑

国际比对,实验室数据,实验数据,组织者

逑２．３．６结果反馈逡逑本次国际比对组织者反馈回来的结果如图２－２所示，图中０９２编号对应着我逡逑们的实验数据。我们的实验数据可以和其它１７个实验室数据中的１３个实验室数逡逑据相互覆盖，这也充分的表明了我的实验结果的准确性和可靠性。逡逑Ｔｏｔａｌ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逦ＲＥＬＡ２０１５逡逑逦邋§逦２ｉ．ｏｅ．ｉ？逡逑Ｂ邋Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋ＬａｂＣｏｄｅ邋９２逦逦逡逑＂６６逦ＬａｂＣｏｄｅ逦Ａ逦ｅ．ｏ．逦Ｂ逦ｅ．ｕ．逦ｒｒ＾ｗｘｌ逡逑？逦７，４７逦０．０９０逦５，９７逦０．０７０逦ｓｐｅｃｔｒｏｃｉｈＣＫ＞ｉｒｉｅｔｒｙ逡逑0逦７，１８７逦＜３，１３Ｓ逦Ｓ．９０２逦Ｏ．ｍ逦ｓｐｆｅＣＴＯｐｈａｔｏｍｇｔｒｙ邋ｒＯｏｕ＾ａｓ；逡逑ｆｅ逦７．５６３逦０，１４２逦５．９７逦０．ｉｔ２逦＾ａｆＯｐｎｏｉＱｉＰｅｔｆｙ邋（Ｄｍｍｓ；逡逑？逦７．Ｓ６逦０．】逦ｔ，０逦０，０９０逦＾ｉｅｃ８00ｆｔＷ0ｔｎｅｉｒ＞逡逑７，３８邋０Ｊ７逦５，８８逦０．Ｕ逦｛Ｄｏｕｍａｓ；逡逑■？６．２逦＿逦逦７．４７逦０．０？０逦＾９３８逦５．０４＾邋ｇｉｅｃｇＯｐｆｉＣＫ－ｉｎＷｙ邋ｉＤｏｕＴ．ａｓ；—逡逑７

序列,纯度测定,电泳

括号中的数字表示含有的氨基酸残基的个数。逡逑３．３．１．２凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）纯度测定结果逡逑如图３－１，邋Ｈ－ＦＡＢＰ条带位于１丨－１７邋ｋＤａ之间，通过Ｑｕａｌｉｔｙ邋Ｏｎｅ软件计算该逡逑条带分子量位１４邋ｋＤａ，与文献报道和理论序列计算结果一致。除目标条带外，逡逑未见其它杂质条带，说明Ｈ－ＦＡＢＰ的蛋白纯度达到要求。逡逑Ｓｔａｉｎｅｄ邋ｇｅｌ逡逑？ｍｍ邋，邋逦逦７２逡逑■＃逦邋ｇｇ逡逑知施痛—３６逡逑淲’逦邋２Ｂ逡逑物ｗ邋—邋邋１７逡逑＂＾＾＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊逡逑图３－１邋Ｈ－ＦＡＢＰ邋ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳纯度测定结果逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－１邋Ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＳＤＳ－ＰＡＧＥ逡逑（左侧泳道为Ｈ－ＦＡＢＰ样品结果，右侧泳道为分子量标准的结果，右侧的数字表示分子逡逑量标准品对应的分子量值，单位为ｋＤａ）逡逑３．３．１．３邋ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分子量测定结果逡逑Ｈ－ＦＡＢＰＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ测定结果如图３－２所示，在１５０００左右的峰为Ｈ－ＦＡＢＰ逡逑的单电荷的质谱峰，７５００左右的的峰为Ｈ－ＦＡＢＰ双电荷峰。总共进行了邋６次测逡逑定

【参考文献】