XBP1s在高糖诱导的人腹膜间皮细胞纤维化中的重要作用

发布时间：2020-08-18 17:37

【摘要】：【研究背景】腹膜透析是基于腹膜生物性半透膜的特性,高糖腹透液与腹膜毛细血管内血液进行物质的跨膜转运,从而实现血液净化的目的。随着手术方式和腹膜透析装置的改进,导管相关的感染和非感染并发症已显著下降,这种情况下,腹膜纤维化就成为长期腹膜透析面临的最大挑战,腹膜纤维化可引起透析效能下降和超滤衰竭,最终导致腹膜透析失败,病人需转为其他肾脏替代治疗。近些年,研究报道了大量关于腹膜透析相关腹膜纤维化新的分子和调控机制,提示在纤维化的早期可能存在潜在的干预位点,但想实现临床上靶向治疗还远远不够。X-盒结合蛋白1(X-box binding protein,XBP1)是肌醇需要酶1(inositol reruiring enzyme 1,IRE1)下游关键的转录调节因子,它通过与靶基因启动子序列中的X盒结合,激活靶基因的转录。IRE1/XBP是未折叠蛋白反应/内质网应激(unfolded protein response,URP/endoplasmic reticulum stress,ERS)中一条重要的信号通路。XBP1s在细胞生长和分化、蛋白分泌、细胞凋亡中具有重要的调控作用。参与了胰岛细胞与唾液腺的分泌、胚胎肝脏的发育以及淋巴细胞的生长分化。文献报道,XBP1s与多种纤维化疾病的发生发展,如支气管囊性纤维、特发性肺纤维化、硬皮病、肝脏纤维化等有密切联系,XBP1s在人腹膜间皮细胞(human peritoneal mesothelial,HPMCs)和腹膜纤维化中的作用尚未见报道。我们课题组前期预实验发现,XBP1s通过激活JNK信号通路,参与介导了炎性因子诱导的HPMCs的炎症反应,并且发现XBP1s抑制剂的使用可以减轻炎症诱导的腹膜纤维化。但XBP1s在高糖刺激的腹膜间皮细胞纤维化中的作用及分子机制如何尚不清楚,需要更进一步的研究来证明。【目的】1.检测不同透龄腹膜透析患者腹膜透析流出液细胞中XBP1s表达水平与纤维化相关分子的表达,初步探讨XBP1s与腹膜纤维化的相关性。2.寻找人腹膜间皮细胞HPMCs在高糖刺激下XBP1s表达水平与纤维化相关分子表达的相关性。3.通过过表达和敲低XBP1s观察其对纤维化相关分子表达的影响,从而从细胞水平验证XBP1s对腹膜纤维化的调控作用。【方法】1.取持续不卧床腹膜透析(Continuous Ambulatory Peritoneal Dialysis,CAPD)患者夜间留腹透析液分离培养流出液细胞,通过qRT-PCR和Western blot技术分别检测XBP1s及上皮细胞表型标志E-cadherin、纤维化标志分子α-SMA、Vimentin、CollagenⅠ、Fibronectin、TGF-β、CTGF的mRNA及蛋白表达情况;2.利用120mM葡萄糖刺激人HPMCs,通过qRT-PCR、Western blot和免疫荧光技术分别检测XBP1s及上皮细胞表型标志E-cadherin、纤维化标志分子α-SMA、Vimentin、CollagenⅠ、Fibronectin、TGF-β、CTGF的mRNA及蛋白表达情况;3.利用XBP1s过表达和shRNA慢病毒感染人HPMCs,建立过表达和干扰细胞系,再给予高糖刺激,观察纤维化相关分子表达情况;4.利用XBP1s过表达和shRNA慢病毒感染CAPD患者腹透液流出细胞中HPMCs,观察纤维化相关分子表达情况。【结果】1.随着透龄的延长,腹透液流出细胞的形态由铺路石样向梭形转变的趋势。qRT-PCR和Western blot结果显示,随着透龄的延长,XBP1s mRNA及蛋白表达均增加;上皮细胞表型标志E-cadherin表达降低,而成纤维细胞表型标志α-SMA、Vimentin、CollagenⅠ、Fibronectin、TGF-β、CTGF等表达增加。2.在高糖刺激的HPMCs中,qRT-PCR和Western blot结果显示,XBP1s表达增加,同时上皮细胞表型标志E-cadherin表达随着刺激时间的延长而降低,而成纤维细胞表型标志α-SMA、Vimentin、CollagenⅠ、Fibronectin、TGF-β、CTGF等表达增加。3.用慢病毒感染方法分别建立了过表达和干扰人HPMCs细胞系,感染效率均能达到或超过80%。过表达XBP1s可以显著增强高糖刺激下上皮细胞表型标志E-cadherin表达的下调,以及成纤维细胞表型标志α-SMA、Vimentin、CollagenⅠ、Fibronectin、TGF-β、CTGF等表达的增加。干扰XBP1s可以显著抑制高糖刺激下上皮细胞表型标志E-cadherin表达的下调,以及成纤维细胞表型标志α-SMA、Vimentin、CollagenⅠ、Fibronectin、TGF-β、CTGF等表达的增加。4.用慢病毒感染方法分别建立了过表达和干扰人原代腹膜间皮细胞(CAPD患者腹透液流出细胞分离培养所得),感染效率均能达到或超过80%。实验结果与结果3相同。【结论】随着透龄的延长,CAPD患者腹膜间皮细胞由上皮细胞向成纤维细胞转变,XBP1s的表达与这一现象呈显著正相关;通过细胞系和原代人HPMCs过表达及敲低XBP1s发现,XBP1s介导高糖刺激的人HPMCs由上皮细胞向成纤维细胞转变。这些发现证明XBP1s是腹膜透析相关腹膜纤维化的重要分子之一,为未来治疗腹膜透析相关腹膜纤维化提供了潜在的治疗靶分子。
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R459.5
【图文】：

腹透,流出液,细胞形态

图 1-1 腹透流出液细胞形态学改变（×200）（A）透龄 6 个月的腹透流出液细胞形态；（B）透龄 12 个月的腹透流出液细胞形态；（C）透龄 33 个月的腹透流出液细胞形态；（D）透龄 45 个月的腹透流出液细胞形态.2 腹膜透析流出液细胞中 XBP1s 表达以β-actin 为内参，qRT-PCR 结果表明：随着透龄的延长，XBP1s 的表达增加（P<0.01），（图 1-2 A）。Western blot 结果同样显示随着透龄的延长，XBP表达增加（P<0.05），（图 1-2 B C）。图 1-2 腹透流出液细胞中 XBP1s 表达情况

腹透,流出液,细胞形态

图 1-1 腹透流出液细胞形态学改变（×200）（A）透龄 6 个月的腹透流出液细胞形态；（B）透龄 12 个月的腹透流出液细胞形态；（C）透龄 33 个月的腹透流出液细胞形态；（D）透龄 45 个月的腹透流出液细胞形态；3.2 腹膜透析流出液细胞中 XBP1s 表达以β-actin 为内参，qRT-PCR 结果表明：随着透龄的延长，XBP1s 的表达明显增加（P<0.01），（图 1-2 A）。Western blot 结果同样显示随着透龄的延长，XBP1s的表达增加（P<0.05），（图 1-2 B C）。

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图 2-1 高糖刺激人 HPMCs 中 XBP1s 表达情况A: 高糖刺激的 HPMCs 中 XBP1s mRNA 表达情况，*P<0.05，**P<0.01；B: 高糖刺激的HPMCs 中 XBP1s 蛋白表达情况；3.2 高糖刺激人 HPMCs 中纤维化相关分子表达情况通过 qRT-PCR 和 Western blot，检测了细胞纤维化相关分子，qRT-PCR 结果提示：上皮细胞表型标志 E-cadherin 表达随着刺激时间的延长而降低，而成纤维细胞标志分子α-SMA、Vimentin、Collagen Ⅰ、Fibronectin、TGF-β、CTGF 等表达增加，如图 2-2 A 所示。蛋白的表达变化基本上与 mRNA 变化一致，如图 2-2B 所示。

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