头孢曲松和阿奇霉素共同耐药志贺菌的流行分布、耐药机制及其传播进化规律研究

发布时间：2020-08-26 04:52

【摘要】：细菌性痢疾是一个严重危害公共卫生健康的全球性问题。在发展中国家,细菌性痢疾已经造成了很大的疾病负担,估计每年至少有8000万人感染,主要是儿童。细菌性痢疾在我国的发病率达每年20.28/10万,每年病例数达25万以上。由于抗生素的长期大量使用,细菌的耐药问题越来越严重,已经成为一个亟待解决的全球性问题。近年来,多重耐药志贺菌成为主要流行菌株,在全球不同地区广泛流行和传播,甚至出现了对头孢曲松和阿奇霉素耐药的志贺菌,给临床治疗和公共卫生防控工作带来了极大困难和挑战。2015年在我国广西地区甚至还出现了一起由对头孢曲松和阿奇霉素共同耐药宋内志贺菌引起的水源性暴发事件,这引起了我们对这种耐药表型的极大关注。目前,国内外对头孢曲松和阿奇霉素共同耐药志贺菌的研究报道极为少见,国内还没有关于头孢曲松和阿奇霉素共同耐药志贺菌的流行分布规律的研究。本课题首次开展了头孢曲松和阿奇霉素共同耐药志贺菌在我国的流行分布规律研究,为今后细菌性痢疾的科学防控提供了重要参考依据。本研究的目的是通过志贺菌的耐药性分析以及结合流行病学资料的统计分析,明确头孢曲松和阿奇霉素共同耐药志贺菌在我国的流行分布规律;通过耐药基因检测、质粒图谱、接合转移、Southern杂交和质粒测序等分析,揭示我国头孢曲松和阿奇霉素共同耐药志贺菌的耐药机制;通过对我国不同年代和地区的头孢曲松和阿奇霉素共同耐药宋内志贺菌代表菌株的基因组测序和系统进化分析,探究其传播进化规律以及耐药基因的转移在传播进化中作用和意义。本研究通过对实验室历年分离鉴定出的4237株志贺菌进行药敏实验筛查,共筛查出1327(31.3%)株对头孢曲松耐药的志贺菌。由于课题开展早期缺乏志贺菌对阿奇霉素耐药的标准,根据文献报道的mph(A)基因作为介导志贺菌对阿奇霉素耐药的重要机制,将mph(A)阳性视为阿奇霉素耐药,我们对mph(A)基因进行了筛查,共筛查出779株(18.4%)mph(A)阳性志贺菌,并且通过部分mph(A)阳性志贺菌对阿奇霉素的药敏试验验证,参考2016年CLSI提出的志贺菌对阿奇霉素的耐药标准,mph(A)阳性宋内志贺菌100%(42/42)对阿奇霉素耐药(≥32μg/mL),mph(A)阳性福氏志贺菌73.9%(34/46)对阿奇霉素耐药(≥16μg/mL)。综合上述分析,本研究共筛查出头孢曲松和阿奇霉素共同耐药志贺菌399株,总检出率为9.4%;其中头孢曲松和阿奇霉素共同耐药宋内志贺菌211株,检出率为11.5%;头孢曲松和阿奇霉素共同耐药福氏志贺菌188株,检出率为7.8%。头孢曲松和阿奇霉素共同耐药志贺菌从2003-2004年就已经在我国出现,并且呈现不断上升的流行趋势,从2003-2004年的0.4%上升到2013-2014年的13.2%。在我国安徽(18.2%)、河南(16.4%)、上海(15.4%)、甘肃(8.4%)、湖北(8.3%)、广西(6.9%)、山西(5.2%)、北京(4.0%)、四川(3.8%)和新疆(2.9%)10个省市都筛查出了头孢曲松和阿奇霉素共同耐药志贺菌;只有辽宁、云南、贵州和广东4个省并未筛查得到,可能跟这些地区收集的志贺菌菌株数量较少有关。耐药性分析显示,头孢曲松和阿奇霉素共同耐药志贺菌对头孢他啶、哌拉西林、头孢哌酮、头孢唑啉、妥布霉素、庆大霉素、替卡西林、替卡西林/克拉维酸、氨曲南、氨苄西林和复方新诺明的耐药率要高于非共同耐药志贺菌(P0.05);相反,头孢曲松和阿奇霉素共同耐药志贺菌对四环素、氯霉素和诺氟沙星的耐药率要低于非共同耐药志贺菌(P0.05)。以上结果表明头孢曲松和阿奇霉素共同耐药志贺菌在我国分布广泛,呈现不断上升的流行趋势,并且在宋内志贺菌中的检出率要明显高于福氏志贺菌,头孢曲松和阿奇霉素共同耐药志贺菌的抗生素耐药性要明显高于非共同耐药志贺菌。因此,我们应该加强对头孢曲松和阿奇霉素共同耐药志贺菌的流行病学监测,为细菌性痢疾的科学防控提供参考依据。本研究采用常规PCR方法对399株头孢曲松和阿奇霉素共同耐药志贺菌的耐药基因进行了检测,结果显示在ESBLs耐药基因中主要以bla_(CTX-M)(88.7%)为主,其次是bla_(TEM)(65.4%)和bla_(OXA)(41.6%),未检测出bla_(VIM)。在bla_(CTX-M)中,测序分析结果显示主要以bla_(CTX-M-14)(59.9%)为主,其次是bla_(CTX-M-55)(18.1%)和bla_(CTX-M-15)(12.1%)。整合子相关基因中,IntI2的阳性率高达93.2%,IntI1的阳性率达67.7%,而2类整合子基因盒的阳性率也达到了70.7%。通过对78株bla_(CTX-M)和mph(A)基因阳性的志贺菌进行S1-PFGE和Southern Blot杂交分析,除了1株bla_(CTX-M-15)基因不在质粒上和1株bla_(CTX-M-55)基因与mph(A)基因在不同的质粒上,其余的菌株中bla_(CTX-M-14)、bla_(CTX-M-55)和bla_(CTX-M-15)基因分别与mph(A)基因同时定位在大小相同的质粒上,而且质粒接合转移试验证实这些质粒能够在自然状态下水平转移。10株质粒的测序分析结果显示这些质粒的类型包括IncF型(8/10)、IncI(1/10)型和IncB/O/K/Z型(1/10),以IncF型为主;在bla_(CTX-M)基因上游主要存在插入序列ISEcp1,而在mph(A)基因上下游主要存在IS26和IS6100,这些插入序列的存在可能跟bla_(CTX-M)和mph(A)基因的表达、活化或转移有关。通过以上研究结果说明携带bla_(CTX-M)和mph(A)基因的质粒是介导志贺菌对头孢曲松和阿奇霉素产生共同耐药的重要机制,并且可能作为细菌种内、种间和属间基因转移的重要机制而导致这些耐药基因的迅速传播扩散,对我们今后的细菌性痢疾的防治工作提出了严峻挑战。基于头孢曲松和阿奇霉素共同耐药志贺菌在宋内志贺菌中较高的检出率和增长趋势,本研究主要对宋内志贺菌尤其是对头孢曲松和阿奇霉素共同耐药的宋内志贺菌在我国的传播进化规律进行了研究,并探讨了耐药基因的转移在进化中意义,目前总共完成了408株宋内志贺菌的全基因组测序,其中包括133株头孢曲松和阿奇霉素共同耐药的宋内志贺菌和275株非共同耐药志贺菌。本研究采用Holt实验室建立的reddog流程进行SNP鉴定,在此基础上使用最大似然法(ML)构建系统发育树;使用BEAST软件预测SNP的变异速率及祖先分化时间,并利用SRST2软件进行耐药基因分析。结果显示宋内志贺菌在全球进化过程中形成了4个独特的遗传分支,而我国的分支主要源于Lineage III,在后期传播进化过程中逐渐形成了一个独立的分支,并且广西地区的菌株尤其是头孢曲松和阿奇霉素共同耐药宋内志贺菌的疫情菌株在进化树上出现了显著集群现象,形成了一个相对独立的小分支。贝叶斯系统分化时间推测,1980s年代早期宋内志贺菌就已经传入国内,到了1980s年代后期就已经广泛流行并形成一个相对独立的大分支,在1990s年代开始逐渐分化成两个相对独立的分支。从宋内志贺菌系统发育树上抗生素耐药基因的分布上来看,我国的志贺菌分支与国外分支存在明显差异,耐药基因种类和数量明显多于国外的分支,普遍存在着bla_(TEM)、bla_(CTX-M)型ESBLs耐药基因和mph(A)大环内酯类耐药基因,并且同时携带bla_(CTX-M)和mph(A)基因的菌株在国内还形成了相对独立的小分支,表明这些耐药基因的转移获取对我国宋内志贺菌的传播进化发挥着重要的作用。综上所述,本研究开展了头孢曲松和阿奇霉素共同耐药志贺菌在我国的流行分布规律及其耐药机制的研究,并通过全基因组测序对宋内志贺菌在我国的传播进化规律进行研究,探讨了耐药基因在宋内志贺菌微进化过程中的重要意义。以上这些研究结果为今后细菌性痢疾的监测工作具有重要的指导意义,为有效预防头孢曲松和阿奇霉素共同耐药志贺菌引起的公共卫生事件以及制定科学合理的防控策略提供了科学依据。
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R446.5
【图文】：

趋势图,福氏志贺菌,耐药率,时间变化

图 1-1 宋内和福氏志贺菌对头孢曲松耐药率的时间变化趋势 mph(A)基因筛查及其阿奇霉素药敏结果志贺菌 mph(A)基因的筛查结果显示（表 1-3）：4237 株志贺菌中 mph(A)基性的菌株一共有 779 株，总阳性率为 18.4%，mph(A)基因的阳性率从 2003-20的 5.9%增至 2013-2014 年的 24.8%；在宋内和福氏志贺菌中分别有 440 株和 3 mph(A)阳性菌株，阳性率分别为 24.0%和 14.1%，宋内志贺菌中的阳性率要高氏志贺菌，差异具有统计学意义（P<0.05）。宋内和福氏志贺菌中 mph(A)的率随时间变化呈现出明显的上升趋势（图 1-2）。表 1-3 志贺菌 mph(A)基因检测结果年份宋内志贺菌福氏志贺菌总志贺菌n/N 阳性率 n/N 阳性率 n/N 阳性率2003-2004 3/58 5.2% 11/181 6.1% 14/239 5.9%2005-2006 14/120 11.7% 23/359 6.4% 37/479 7.7%

趋势图,福氏志贺菌,阿奇霉素,志贺菌

图 1-2 宋内和福氏志贺菌 mph(A)阳性率的时间变化趋势mph(A)阳性志贺菌对阿奇霉素的药敏结果显示（表 1-4）：42 株 mph(A)阳宋内志贺菌，其阿奇霉素的 MIC 值全部大于 32μg/mL；而 46 株 mph(A)阳性氏志贺菌，阿奇霉素 MIC 值小于 8μg/mL 的有 4 株（8.7%），大于 8μg/mL 的2 株（91.3%），大于 16μg/mL 有 34 株（73.9%），大于 32μg/mL 的有 24 株（52.2%考 2016 年 CLSI 提出的志贺菌对阿奇霉素的耐药标准（宋内志贺菌≥32μg/m氏志贺菌≥16μg/mL），mph(A)阳性宋内志贺菌 100%（42/42）对阿奇霉素耐ph(A)阳性福氏志贺菌 73.9%（34/46）对阿奇霉素耐药。表 1-4 mph(A)阳性志贺菌的阿奇霉素耐药结果阿奇霉素 MIC 宋内志贺菌（株）福氏志贺菌（株）>2μg/mL 0 1>4μg/mL 0 3>8μg/mL 0 8

趋势图,志贺菌,耐药,检出率

第 15 页图 1-4 共同耐药志贺菌检出率的时间变化趋势.5 共同耐药志贺菌的地区分布全国 14 个省市的共同耐药志贺菌的检出情况如表 1-7 所示，共有 10 个省市

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