基于贵金属高灵敏探针的设计、构建及其在免疫分析中的应用

发布时间：2020-08-26 14:45

【摘要】：酶联免疫吸附和免疫组化是生物分析和临床诊断中经典的检测手段,但是这两种方法由于灵敏度较低,并不能满足发病初期对病原标志物的诊断。本论文主要是针对这两种免疫分析方法进行信号放大系统构建,提高检测灵敏度:1)基于重复单元信号放大体系制备AuNP-PAMAM聚集体用于绒毛膜促性腺激素(hCG);2)基于纳米酶与生物酶双催化作用提升免疫分析中的信号,并采用hCG进行了响应信号的研究;3)构建高催化活性的Pd-Ru-Ir三元金属纳米酶体系,并应用于免疫组化研究中,响应信号提升8.7倍。1、采用生物素和巯基化的PAMAM聚合物诱导纳米金聚集,并且与抗体偶联,形成一种类项链状的聚集体AuNP-PAMAM探针,该聚集体由多个纳米金重复结构单元组成,平均粒径达156 nm。将探针用于hCG的检测,线性区间为0.10-6.40 IU/L,灵敏度高达0.03 IU/L,与传统的BA-ELISA(0.8 IU/L)和经典的纳米金为载体的荧光探针(0.6IU/L)进行比较,AuNP-PAMAM探针灵敏度具有明显优势优势。2、构建了纳米酶和HRP双催化的Au@Pt-HRP探针,将该探针用于检测hCG,灵敏度高达0.10 IU/L,线性区间是0.40-12.80 IU/L,与BA-ELISA相比较而言,优势较明显,灵敏度提升近8倍。对于Au@Pt纳米酶表面结合的HRP进行了计算,结果表明,21-22个HRP分子能结合在Au@Pt纳米酶表面,超出传统的信号放大载体纳米金能结合的HRP分子数(11-12)。3、对于中空(Ag-Pt,Ag-Pd)和多孔状(Pd-Pt)等三种纳米酶的催化活性进行了研究:多孔Pd-Pt纳米酶在TMB-H_2O_2的催化体系中活性最强。基于双催化探针的观念,合成了Pd-Pt-HRP探针,用于检测hCG,灵敏度高达0.07 IU/L。并通过XPS和TEM表征及氮吸附脱附实验等手段证明HRP分子能够进入Pd-Pt表面的孔道中。进一步的对该纳米酶表面的HRP分子数量做了计算,约31-32个酶分子能结合上该纳米酶。最后对纳米酶的两种基础晶面进行了合成,Pd-Pt八面体((111)晶面)纳米酶在催化作用中占据优势。4、对铂系金属中的四种贵金属(Rh、Ru、Pt和Ir)的催化性能做了比较,Ir更适合TMB-H_2O_2体系。并在此基础上,合成了三元金属Pd-M-Ir(M=Rh、Ru和Au),对于Ir元素而言,在TMB-H_2O_2的催化体系中,催化活性随着d-band中心的下降而上升,将活性最高的Pd-Ru-Ir纳米酶应用于免疫组化中,所得到的光密度平均值高于商业化免疫组化信号8.7倍。
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R446.6
【图文】：

境分析等领域有着广泛的应用。在临床上，常用于生物标志物的，免疫分析法主要是利用抗体对抗原的识别作用，同时在抗体上号分子的信号输出强度对生物标志物的浓度进行检测。根据信号分析法主要分为以下几个大类：放射性免疫分析、化学发光免疫析[2]、胶体金免疫技术[3]、免疫组化和酶联免疫吸附（ELISA)。A 最为常用，ELISA 常作为检测生物标志物的金标准。免疫吸附 是免疫分析方法测定中的金标准，历经近半个世纪的发展，是在的生物标志物的分析手段。该技术操作简便、快速、易于标准化用的分析手段之一。酶联免疫吸附中，一般以碱性磷酸酶，辣根ish Peroxidase；HRP）做为标记抗体的酶。HRP 标记抗体，以双物标志物，双抗夹心 ELISA 的基本过程如下图所示（图 1-1）。

华南理工大学博士学位论文用于 ELISA 作为显色试剂，并且通常是评价酶性能的底物；DAB-H2O2体系中，在有纳米酶测存在下，底物能被迅速催化氧化显暗棕色，且能观察到有棕色沉淀产生，由于催化产物的溶解性较低，通常被氧化之后会结晶析出，沉积在细胞或者组织表面，起到定位作用，因此该类催化底物通常用于免疫组化中；OPD-H2O2体系中，在有 HRP 的存在下，底物能被迅速催化氧化显红棕色，氧化产物在 446 nm 处有比较明显的紫外吸收峰，该试剂也曾被用于ELISA中，但是氧化产物的摩尔消光系数相对较低（16700 M 1cm 1）所以逐渐被 TMB 所取代[8]；与其他蛋白质一样，HRP 的活性也受很多因素的影响，pH和温度就是比较典型的影响因素，另外，一些小分子物质，例如叠氮化钠和氟化物等，也会对 HRP 的催化活性起到抑制作用。

也曾被用于ELISA中，但是氧化产物的摩尔消光系数相对较低（16700 M 1渐被 TMB 所取代[8]；与其他蛋白质一样，HRP 的活性也受很多因素的影就是比较典型的影响因素，另外，一些小分子物质，例如叠氮化钠和氟 HRP 的催化活性起到抑制作用。图 1-2 辣根过氧化物酶的结构图（a）以及活性中心（b）Figure 1-2 The structure diagram of HRP (a) and the active center (b)

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本文编号：2805309