黄金海岸沙门菌耐药性和携带伤寒沙门菌毒力基因研究

发布时间：2020-08-28 19:45

　　目的研究临床分离黄金海岸沙门菌对常用抗菌药物的敏感性、对氟喹诺酮和β-内酰胺类抗菌药物的耐药机制以及携带伤寒沙门菌毒力基因的特点,为理解非伤寒沙门菌耐药与毒力变化趋势、预防与治疗沙门菌感染和抗菌药物合理应用提供依据。方法1、收集2014年4-10月我市两家教学医院肠道门诊急性腹泻患者的临床资料,采集患者粪便标本进行沙门菌分离培养、生化和PCR鉴定、血清型分型。2、药物敏感试验:对鉴定得到的黄金海岸沙门菌采用微量肉汤稀释法和纸片法进行17种抗菌药物敏感性检测。3、分子分型:进行多位点序列分型(MLST)。4、氟喹诺酮耐药基因分析:PCR扩增喹诺酮靶位基因gyrA、gyrB、parC、parE的喹诺酮耐药决定区(QRDR)并测序,PCR扩增质粒介导的喹诺酮耐药(PMQR)基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、aac(6’)-Ib-cr、qepA、oxqAB并对阳性产物测序,对以上测序结果进行Blast和BioEdit、MEGA5分析。5、?-内酰胺酶基因分析:PCR扩增?-内酰胺酶耐药基因TEM、SHV、CTX-M、OXA,对阳性扩增产物测序并进行Blast和ClustalX分析。6、cdtB-毒力岛和伤寒沙门菌相关毒力基因检测:PCR扩增cdtB-毒力岛编码序列、非编码序列,以及hlyE、taiA、tcfA,对阳性扩增产物测序并进行Blast和BioEdit、MEGA5分析。结果1、2014年从我市两家教学医院肠道门诊的急性腹泻患者粪便标本中共分离鉴定得到3株黄金海岸沙门菌,占同期全部非伤寒沙门菌的0.03%(3/108)。3例患者有2例临床诊断为急性胃肠炎,1例临床诊断为急性细菌性痢疾。2、药敏试验显示3株黄金海岸沙门菌都是多重耐药株,对氨苄西林、哌拉西林/他唑巴坦、培氟沙星、氯霉素、复方新诺明都耐药,对阿莫西林/克拉维酸、环丙沙星和左氧氟沙星都中介,有2株(2/3)对氨苄西林/舒巴坦、四环素、链霉素、庆大霉素、依替米星和阿奇霉素为耐药或中介,对萘啶酸、头孢曲松和厄他培南都敏感。3、MLST分型发现2株黄金海岸沙门菌为ST358,1株为ST2529。4、3株黄金海岸沙门菌的QRDR与对氟喹诺酮敏感的鼠伤寒沙门菌相比,gyrA、gyrB和parE的DNA和氨基酸序列相似性都是100%,parC的DNA序列相似性都为99%,都出现导致Thr57-Ser氨基酸替换的碱基突变。5、3株黄金海岸沙门菌均扩增出预期长度的qnrS基因片段,序列分析显示与鼠伤寒沙门菌qnrS1的DNA相似性都为99%,氨基酸相似性都为100%。qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、aac(6′)-Ib-cr、qepA及oqxAB的PCR扩增结果均为阴性。6、3株黄金海岸沙门菌均扩增出TEM基因的预期长度片段,与鼠伤寒沙门菌TEM-1b基因DNA序列相似性都为99%,氨基酸序列相似性都为100%。SHV、OXA和CTX-M的PCR扩增结果均为阴性。7、3株黄金海岸沙门菌都能扩增出预期长度大小的sty1887、sty1889和phage基因片段,与伤寒沙门菌CT18相比,DNA和氨基酸序列相似性分别为100%、100%和98%。序列分析显示,3株黄金海岸沙门菌与伤寒沙门菌CT18的cdtB-毒力岛的基因构成完全一致,都包含cdtB、sty1887、sty1889、pltA、pltB和phage等基因,而且顺序和转录方向完全相同。8、3株黄金海岸沙门菌都能扩增出预期长度大小的hlyE、taiA和tcfA基因片段,与伤寒沙门菌CT18相比,DNA序列相似性依次为99%、100%和99%,氨基酸序列相似性依次为100%、100%和99%。结论1、本研究从临床分离到2株ST358型和1株ST2529型黄金海岸沙门菌,都是多重耐药株。2、本研究中黄金海岸沙门菌qnrS1和TEM-1b都阳性,分别介导了菌株对氟喹诺酮中介、对?-内酰胺/?-内酰胺酶抑制剂耐药或中介。3、黄金海岸沙门菌临床株携带伤寒沙门菌相关毒力因子cdtB-毒力岛、hlyE、taiA和tcfA,对菌株致病力的影响值得进一步研究。4、本地区临床出现多重耐药而且伤寒沙门菌毒力因子阳性的黄金海岸沙门菌,要高度重视和持续研究非伤寒沙门菌的耐药和毒力变化。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R446.5;R516.3
【部分图文】：

示意图,非编码,编码基因,基因

图 1.1 cdtB-毒力岛各编码基因和非编码基因 PCR 扩增示意图表 1.6 cdtB-毒力岛的引物序列、退火温度和位置产物引物序列长度退火温度位置P1Int1-F AGGCTGATATGTGGCTGGTC978bp 57℃1784487Int2-R TCACTGATATTAGCGCAGGCA 1785464P2cdtB-F GAAACAAGTCAGGCATTGCC1059bp 55℃1785283cdtB-R GAATGGCTCATAAACACGCC 1786341P3Sty1887-F TCATTGTCGATCGAGCACCTT771bp 57℃1786094Sty1887-R GTTAGCTGAAAAGCGCCAGG 1786864P4Sty1889-F TGGCTTTCACCAGTTCTCTGT671bp 56℃1786718Sty1889-R ACCAATCATAGCATTCAGGTACG 1787388P5Int2-F AGGGTGATCAACGTAACCGC673bp 57℃1787275

电泳图,沙门菌,基因,电泳

图 2.1 3 株黄金海岸沙门菌 PMQR 基因 PCR 产物电泳结果：M 为 DNA 标志物 DL2000；1、2、3、4 为 3250 的 qnrA、qnrB、5、6、7 为 qnrS 的 3250、3253、G1150；8、9、10、11 为 3250 的 aac(6OqxA、OqxB该3株黄金海岸沙门菌qnrS基因的PCR产物进行测序，并将序列进结果显示该 3 株黄金海岸沙门菌 qnrS 基因 DNA 序列相互之间完全寒沙门菌 484 的 qnrS1 基因（GenBank NO.JN393220.1）DNA 序列%，发生第 181 位碱基 T-C 突变，而氨基酸序列的相似性则为 100%黄金海岸沙门菌携带的 qnrS 基因为 qnrS1。序列分析结果见图 2.2

沙门菌,碱基,灰色,氨基酸

图 2.2 3 株黄金海岸沙门菌 qnrS1 的 DNA 序列（灰色背景表示碱基或氨基酸的差异,下同）图 2.3 3 株黄金海岸沙门菌 qnrS1 的氨基酸序列 -内酰胺酶基因扩增与序列分析对 3 株黄金海岸沙门菌进行 TEM、SHV、OXA 和 CTX-M 基因的 PCR 扩增，该3 株菌都扩增出 TEM 基因的预期长度片段（931bp），SHV、OXA 和 CTX-M 的 PCR

【参考文献】