靶向载金纳米棒液态氟碳纳米粒双模态显像及治疗裸鼠恶性黑色素瘤的实验研究

发布时间：2020-08-28 20:30

　　 第一部分:靶向载金纳米棒液态氟碳纳米粒的制备、表征研究目的:构建一种高生物相容性的新型靶向相变型载金纳米棒的液态氟碳纳米粒(Melanoma-associated antigens targeting gold nanorod and perfluorohexane encapsulated PLGA NPs,MAGE-Au-PFH-NPs),检测其一般物理特性,光学特性,相变能力及靶向能力。方法:采用双乳化法制备包裹金纳米棒(gold nanorod,GNR/AuNRs)及液态氟碳(perfluorohexane,PFH)的PLGA纳米粒(gold nanoparticle,GNPs)。碳二亚胺法连接靶向恶性黑色素瘤的单克隆抗体(黑色素瘤相关抗原melanoma-associated antigens抗体MAGE-1-Antibody),制备高分子多功能靶向型PLGA纳米分子探针(MAGEAu-PFH-NPs)。透射电镜及扫描电镜下观察纳米粒的形态大小、分散度;马尔文粒径仪检测其粒径、电位;紫外分光光度仪测定纳米粒包封率;光声成像仪检测纳米粒最大吸收峰;将MAGE-Au-PFH-NPs与黑色素瘤B16细胞共孵育,观察NPs的体外靶向能力;测试不同浓度的纳米粒对B16细胞活性的影响;采用808nm激光仪体外辐照纳米粒,红外成像仪测定记录其光热转换效率,激光辐照后光学显微镜下观察纳米探针相变能力。结果:成功制备的靶向载金纳米棒多功能纳米分子探针,光镜下观察形态均匀,分散度均一,电镜观察纳米粒粒径500nm。马尔文粒径仪测纳米粒平均粒径为354.27±23.31 nm,Zeta电位(-4.76±3.7)mV;紫外分光光度计测包封率:70.61±7.27%。间接免疫荧光法观察到抗体成功连接到纳米探针表面;激光共聚焦显微镜检测体外寻靶能力实验显示黑色素瘤B16细胞株周围有大量靶向纳米探针环绕;光声成像仪检测其最大吸收峰波长在780nm附近。近红外摄像仪记录靶向相变型纳米粒光热转换效率良好,激光辐照纳米粒后可升温至71°C,并可在倒置显微镜下观察到纳米粒相变为微米级的微气泡。不同浓度的纳米粒与B16细胞共孵育24小时后,CCK-8检测各组细胞活性无影响结论:MAGE-Antibody偶联相变型金纳米棒纳米探针制备成功,粒径均一,包封率高,具备良好的光学特性。光热转换效率高,能促发纳米粒相变。故其具备增强光声及超声成像能力。对体外恶性黑色素瘤细胞具有较好的生物活性,并且细胞靶向性较好。因此,MAGE-Au-PFHNPs是一种新型的多功能的靶向纳米级探针,为后续增强光声及超声成像以及肿瘤的光热治疗奠定了实验基础。第二部分:靶向载金纳米棒液态氟碳纳米粒增强光声、超声显像研究目的:体外及体内实验研究靶向载金纳米棒相变型液态氟碳纳米粒增强光声/超声显像效果。方法:体外研究采用琼脂糖凝胶模型,模型孔洞中分别加入不同浓度的靶向载金纳米棒液态氟碳纳米粒(MAGE-Au-FPH-NPs)及非靶向载金纳米棒液态氟他纳米粒(Au-FPH-NPs),后使用光声成像仪及超声诊断仪采集图像,并进行光声强度及超声灰阶、声强记录分析。体内研究方法:体外培养黑色素瘤B16细胞,建立B16黑色素瘤荷瘤裸鼠模型,分别经尾静脉注入靶向与非靶向纳米粒MAGE-Au-FPH-NPs、AuFPH-NPs,尾静脉注药后接受808nm激光治疗仪辐照肿瘤区,后使用光声成像仪及超声诊断仪采集图像并分析。结果:体外光声成像显示随金纳米粒含量增加,其光声信号呈逐渐增强趋势。体外超声结果显示:808激光仪辐照后纳米粒探针有明显的基波及谐波增强信号。体内研究显示:黑色素瘤荷瘤裸鼠尾静脉注射MAGE-Au-PFH-NPs后,PA信号随时间逐渐升高,在尾静脉注射MAGE-Au PFH-NPs后2 h达到峰值,MAGE-Au-PFH-NPs组在2h时的PA强度值高于Au-PFH-NPs组。而在注射Au-PFH-NPs后1h内没有PA信号,注射后2h内只有微弱信号,注射后24h后消失。结论:证明靶向MAGE-Au-PFH-NPs具有明显的光声成像效果,能增强超声显像,并能特异性靶向黑色素瘤,可作为光声/超声双模态成像造影剂,用于肿瘤的诊疗。第三部分:靶向相变型载金纳米粒光热消融治疗及监测黑色素瘤的研究目的:研究观察靶向相变型载金纳米粒对B16黑色素瘤细胞的杀伤作用,研究光热消融联合相变的物理破坏作用对黑色素瘤裸鼠的肿瘤的治疗效果。探讨MAGE-Au-PFH-NPs作为光声/超声双模态成像及诊断治疗一体化的造影剂的应用前景。方法:研究分为两部分,体外研究为:(1)采用808nm激光体外辐照NPs,对MAGE-Au-PFH-NPs的光热性能进行了评价。此外,探讨了不同浓度NPs和不同激光功率对NPs的光热性能的影响。用红外热成像摄像机记录红外辐射(IR)热图像和温度变化。(2)小鼠黑色素瘤B16细胞接种于共聚焦培养皿,分为4组,分别为生理盐水组(NS),单纯激光组(Laser only),MAGE-Au-PFH-NPs纳米粒加激光组(NPs+Laser),单纯纳米粒MAGE-Au-PFH-NPs(NPs only)组。单纯激光组(Laser only)及纳米粒MAGE-Au-PFH-NPs加激光组(NPs+Laser)接收808nm激光治疗仪辐照后,激光共聚焦显微镜下观察细胞凋亡情况,评估MAGE-Au-PFH-NPs纳米粒对肿瘤细胞的杀伤作用。体内研究为:(1)为研究靶向纳米粒体内光热转换效率,将荷瘤裸鼠随机分为三组,分别为靶向相变型MAGE-Au-PFH-NPs和非靶向相变型纳米粒Au-PFH-NPs组以及生理盐水(NS)组。静脉注射100μL MAGE-AuPFH-NPs和Au-PFH-NPs(25mg/m L,NS组静脉注射100μL NS。肿瘤暴露于808nm激光(1.00 W/cm2)下10分钟,用红外热成像摄像机记录肿瘤温度变化和红外辐射(IR)热图像。(2)体内治疗方法如下:黑色素瘤荷瘤裸鼠分为4组,即靶向纳米粒加激光治疗组(MAGE-Au-PFHNPs+Laser),非靶向纳米粒加激光治疗组(Au-PFH-NPs+Laser),非靶向非相变型纳米粒加激光组(Au-NPs+Laser),生理盐水加激光组(NS+Laser)。分别尾静脉注射100μL MAGE-Au-PFH-NPs、Au-PFHNPs、Au-NPs及NS,然后808nm激光治疗仪辐照肿瘤10 min。观察肿瘤消融情况,记录体重、肿瘤体积评估对肿瘤的治疗作用。行HE染色、TUNEL及PCNA免疫组化检测观察肿瘤抑制效果。超声造影成像监测肿瘤消融效果。结果:体外研究结果显示:MAGE-Au-PFH-NPs接受激光辐照后温度明显上升,且上升趋势与纳米粒浓度及激光功率强度的增加明显相关。激光共聚焦下观察,MAGE-Au-PFH-NPs+Laser组对肿瘤细胞有较大杀伤力,单纯激光组仅见少量的肿瘤细胞凋亡。生理盐水组及单纯纳米粒组对细胞存活无影响。体内研究结果显示:MAGE-Au-PFH-NPs+激光组肿瘤表面温度从31.6±1.09°C升高到56.1±2.6°C,Au-PFH-NPs+激光组温度从30.1±1.3°C上升到52.0±2.1°C。相反,单纯激光组小鼠肿瘤区温度仅略有变化。靶向纳米粒MAGE-Au-PFH-NPs+加激光肿瘤组织发生坏死脱落,治疗15天后肿瘤组织完全消失。而其余三组肿瘤治疗后均有不同程度复发。HE染色靶向纳米粒加激光治疗组(MAGEAu-PFH-NPs+Laser)可见大范围肿瘤细胞发生核溶解及核碎裂。TUNEL检测靶向纳米粒加激光治疗组(MAGE-Au-PFH-NPs+Laser)细胞凋亡阳性率明显高于其余三组。PCNA见MAGE-Au-PFH-NPs+Laser组增殖程度较其他三组明显受抑制。超声监测显示:激光辐照第1天肿瘤区域有明显的造影增强信号,随治疗延续观察15天后信号明显减弱直至不能探测。结论:靶向载金相变型纳米粒MAGE-Au-PFH-NPs对黑色素瘤细胞体外杀伤力强,体内能明显消融肿瘤组织,抑制肿瘤生长。能作为稳定性高,生物相容性良好的造影剂应用于肿瘤的诊断治疗一体化。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R445.1;TB383.1
【部分图文】：

图 1-1 （A）MAGE-Au-PFH-NPs 的扫描电镜（B）MAGE-Au-PFH-NPs 的透射电ig. 1-1 （A） SEM image of MAGE-Au-PFH-NPs (B) TEM image of MAGE-Au-PF图 1-2 MAGE-Au-PFH-NPs 粒径（A） 电位（B）分布图Fig.1-2 （A）Size of MAGE-Au-PFH-NPs and (B) Potential of MAGE-Au-PFH-N

图 1-2 MAGE-Au-PFH-NPs 粒径（A） 电位（B）分布图Fig.1-2 （A）Size of MAGE-Au-PFH-NPs and (B) Potential of MAGE-Au-PFH-NPs

图 1-4 (A) 光 微镜检查 Tritc 标记的山羊抗 IgG 抗体连接的 Au-PFH-NPs 和 MAGE-Au-PFH-NPs(B) CLSM 观察 Au-PFH-NPs 和 MAGE-Au-PFH-NPs 对 B16 胞的靶向力。从左 右分 DAPI 染色的 胞核、DiI 染色的 NPs 以及两张 光图像的融 结果。Fig.1-4. (A)Au-PFH-NPs and MAGE-Au-PFH-NPs connected to TRITC-labelled goat anti-

【参考文献】

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1 吴宁;任秋实;李长辉;;光声层析成像研究进展[J];中国医疗设备;2015年02期

2 周洋;王志刚;;液态氟碳相变的研究进展[J];临床超声医学杂志;2012年06期

3 沈红霞;郑元义;周洋;赵建龙;罗银灯;王志刚;;包裹液态氟碳的高分子超声造影剂的制备及体外显影实验[J];中国介入影像与治疗学;2012年04期

本文编号：2808119