T细胞靶向纳米微泡评价心脏移植急性排斥反应的超声分子显像研究

发布时间：2020-09-01 21:32

　　临床上监测心脏移植急性排斥反应需要反复的心肌活检,无创评价急性移植排斥反应仍面临巨大的挑战。本研究旨在制备一种靶向T淋巴细胞的纳米超声微泡,并探讨T淋巴细胞靶向超声分子成像在急性移植排斥反应诊断中的价值。本研究包括以下三个部分:第一部分携带CD3抗体靶向纳米微泡的制备以及性质评价目的制备携带CD3抗体以及同型对照抗体的纳米微泡(NBs),对其表征进行评价。方法采用薄膜水化-机械振荡法制备纳米超声造影剂,通过合适的离心转速和离心时间分离出粒径均一的NBs。使用生物素-亲和素-生物素连接法制备出携带CD3抗体(NBCD3)或者同型对照抗体的NBs(NBcon),体外评价其形态、分布、粒径、电位、浓度、稳定性以及造影效果等,并用荧光显微镜及流式细胞仪检测其载抗体情况。结果(1)通过薄膜水化-机械振荡法制备出的超声造影剂为MBs和NBs的混合物,在分离纯化NBs的过程中,较长的离心时间会导致NBs浓度下降,但是较高的离心转速并不会使NBs的平均粒径明显下降。因此,离心300 rpm,3 min既能够保证NBs的粒径相对较小,也能够维持NBs较高的浓度。(2)制备的载生物素化抗体的NBs为乳白色混悬液,静置后未见明显分层。其形态规则,粒径均一。NBCD3和NBcon的粒径和浓度分别约457.06±52.68 nm,(9.12±0.46)×109个/ml以及460.64±45.51 nm,(9.22±0.63)×109个/ml。二者在粒径、浓度、电位、PDI等各方面没有明显差异。(3)在体外,NBCD3和NBcon均具有良好的粒径稳定性和浓度稳定性以及造影效果。(4)流式细胞学结果显示超过90%的NBCD3(91.5±3.0%)和NBcon(90.5±3.5%)载有CD3抗体或同型对照Ig G。结论本研究成功制备出携带CD3抗体的靶向纳米微泡,其粒径均一,且具有良好的稳定性和造影效果。第二部分携带CD3抗体靶向纳米微泡与T淋巴细胞粘附实验目的验证制备的NBCD3与T淋巴细胞的靶向粘附效果,并评估其对T淋巴细胞的毒性。方法应用磁珠分选试剂盒(阴选)分选大鼠T淋巴细胞,流式细胞学检测其纯度。分别于光学显微镜以及激光共聚焦显微镜下观察NBCD3和NBcon与T淋巴细胞的粘附情况,并通过流式细胞学验证其结合的效率。MTT实验评价NBCD3和NBcon对T淋巴细胞生存率的影响。结果(1)流式细胞学结果显示磁珠分选所得的细胞悬液中95%以上的细胞为T淋巴细胞。(2)与NBCD3孵育后,T淋巴细胞表面见大量的NBCD3粘附,而与NBcon孵育后,几乎没有NBcon粘附于T淋巴细胞表面。流式细胞学定量结果显示粘附有NBCD3的T淋巴细胞比例(35.4±9.7%)明显高于NBcon组(0.33±0.2%),差异具有统计学意义(P0.05)。(3)T淋巴细胞与不同比例的NBCD3和NBcon孵育后,其存活率未受明显影响。结论本研究制备的NBCD3,能够与T淋巴细胞特异性结合,且对T淋巴细胞无明显毒性。NBCD3的成功制备使得在后续动物实验中实现T淋巴细胞靶向超声分子成像成为可能。第三部分携带CD3抗体靶向纳米微泡超声造影评价大鼠心脏移植急性排斥反应目的评价T淋巴细胞靶向超声分子成像在诊断大鼠心脏移植急性排斥反应中的价值。方法制备大鼠腹腔异位心脏移植模型,分别行NBCD3和NBcon超声分子成像,并用击破-再灌注法对局部粘附的超声信号进行定量评价。活体成像评估NBs在大鼠体内的分布情况,注射Di I标记NBCD3取心肌组织做冰冻切片,激光共聚焦显微镜下观察评价NBCD3在移植心脏中的分布。HE染色、免疫组化染色以及Western Blot检测评价急性移植排斥反应的程度以及T淋巴细胞浸润情况,并将T淋巴细胞浸润程度与超声分子成像的结果进行相关性分析。结果(1)共对33只大鼠(16只同种移植大鼠和17只同系移植大鼠)行超声分子成像。(2)经尾静脉注射后,NBs迅速分布至全身,主要集中于肝脏和脾脏。(3)注射Di I标记NBCD3后,同种移植大鼠心肌间质中可见红色荧光显示,而同系移植大鼠心肌间质中未见明显红色荧光显示。(4)在移植心脏部位,同种移植大鼠NBCD3的信号强度明显高于NBcon(2.86±2.05 d B vs 0.85±0.47 d B,P0.01),同时也明显高于同系移植大鼠NBCD3的信号强度(2.86±2.05 d B vs 0.71±0.29 d B,P0.01);而同系移植大鼠NBCD3的信号强度与NBcon的信号强度无明显差异(0.71±0.29 d B vs 0.69±0.29 d B,P0.05)。(5)NBCD3的信号强度与T淋巴细胞浸润程度呈正相关(R2=0.67,P0.01),而NBcon的信号强度与T淋巴细胞浸润程度无明显相关性(R2=0.03,P0.05)。结论T淋巴细胞靶向超声分子成像能够诊断急性移植排斥反应,有望为无创评价急性移植排斥反应提供一种新方法。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R654.2;R445.1
【部分图文】：

模式图,模式图,抗体,离心转速

3.1.2 纳米超声微泡的分离经薄膜水化法制备的磷脂溶液使用时用机械振荡器振荡 30 s，获得微泡（microbubbles, MBs）和 NBs 的混合物，随后采用离心的方法分离上层粒径较大的MBs 和下层粒径较小的 NBs。文献报道离心转速和离心时间是影响 NBs 分离的两大主要因素[1-3]。为了获得粒径相对较小的 NBs，同时避免材料的浪费，本研究将 MBs和 NBs 的混合物进行不同的离心处理，通过比较不同的离心转速和离心时间组合 NBs粒径和浓度的变化，寻求合适的离心参数。具体方法如下：(1) 为评价离心时间对 NBs 粒径和浓度的影响，将离心转速固定为 300 rpm，分别比较离心 1 min, 3 min, 5 min 和 10 min 时 NBs 的粒径和浓度。(2) 为评价离心转速对 NBs 粒径和浓度的影响，将离心时间固定为 3 min，分别比较离心 100 rpm, 300 rpm, 500 rpm 和 1000 rpm 时 NBs 的粒径和浓度。3.2 携带生物素化抗体纳米超声微泡的制备

机械振荡,脂质,外观,溶液

图 2 机械振荡前后脂质溶液外观。（A）脂质溶液为透明液体；（B）脂质溶液机械振荡后为乳白色混悬液；（C）乳白色混悬液静置后分为上下两层。当离心转速为 300 rpm 时，随着离心时间从 1 min 增加到 10 min，NBs 浓度逐渐下降，见图 3A（P < 0.05）。离心 1 min，3 min，5 min 和 10 min 组 NBs 的平均粒径分别为 690.86 ±38.85 nm, 453.02 ±18.52 nm, 435.12 ±27.86 nm, 438.54 ±23.04 nm。如图 3A 所示，3 min，5 min 和 10 min 组 NBs 的平均粒径均小于 1 min 组（P < 0.05），但三组之间平均粒径差异无统计学意义（P > 0.05）。当离心时间为 3 min 时，随着离心转速从 100 rpm 增加到 1000 rpm，NBs 的浓度也逐渐下降，见图 3B（P < 0.05）。离心 100 rpm，300 rpm，500 rpm 和 1000 rpm 组的平均粒径分别为 596.38 ± 32.23 nm，453.02 ± 18.52 nm，445.12 ± 27.23 nm 和395±15.71nm。如图 3B 所示，随着离心转速增加，NBs 的平均粒径逐渐下降（P < 0.05），但是 300 rpm 组和 500 rpm 组 NBs 的平均粒径差异无统计学意义（P > 0.05）。

离心时间,粒径,转速,平均粒径

22离心时间和离心转速对 NBs 粒径和浓度的影响。（A）随着离心时间的增加径和浓度均下降，离心 3 min，5 min 和 10 min 组 NBs 的平均粒径无明显差min 组比较，P < 0.05。(B) 随着离心转速的增加，NBs 的粒径和浓度均下300 rpm和500 rpm组NBs的平均粒径无明显差异。&与100 rpm组比较，P 00 rpm 组比较，P < 0.05。Bs 理化性质评价

【参考文献】