卵巢癌患者与健康志愿者脂联素水平检测及脂联素对卵巢癌细胞增殖与凋亡的调控作用研究

发布时间：2020-09-08 18:42

　　目的:卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,由于其发病和进展隐匿,早期多无明显症状,就诊时70%已属晚期,病死率居于前列。鉴于卵巢癌的高发病率和致死率,以及在流行病学上脂联素与癌症的密切关系,本课题旨在探索脂联素对卵巢癌细胞的增殖及凋亡有无影响以及可能的作用机制。方法:一、卵巢癌患者与健康志愿者脂联素水平检测1.卵巢癌患者与健康志愿者脂联素水平检测收集2013年1月至2013年12月间就诊于中国医科大学第一附属医院的卵巢癌患者的血清标本46份及腹水标本25份,标本满足如下条件:(a)患者均为经过病理学确诊的卵巢癌患者,(b)以FIGO国际分期法分期明确的患者,(c)无高血压、糖尿病等慢性病史。2.收集正常对照血清标本17份,来源于2013年1月-2013年12月间于中国医科大学第一附属医院体检的志愿者。志愿者满足如下条件:体检中未发现肿瘤及妇科疾病、无高血压、糖尿病等慢性病史的健康女性。3.双抗体夹心ELISA法检测血清及腹水标本的脂联素水平。二、脂联素对卵巢癌细胞增殖的影响1.用Real-time PCR法及Western blotting法检测卵巢癌SKOV3、Caov3细胞脂联素受体1的表达水平。2.MTT比色法观察卵巢癌SKOV3、Caov3细胞在不同浓度(0,5,10,50,100,200ng/ml)外源性脂联素作用48小时后细胞的增殖情况。同法观察以100ng/ml的外源性脂联素刺激后不同时间点(24,48,72小时)细胞的增殖情况。3.采用Real-time PCR法及Western Blotting法观察卵巢癌SKOV3、Caov3细胞在外源性脂联素(100ng/ml)刺激48小时后细胞周期蛋白cyclin B的表达水平。4.采用Western Blotting法分析比较三个组(未处理组、H_2O_2(50μM)处理组以及H_2O_2(50μM)+脂联素处理组)的Caov3细胞的凋亡相关蛋白caspase-3、Bax的蛋白表达水平;同法比较SKOV3细胞三个亚组的凋亡相关蛋白caspase-3、Bax的蛋白表达水平。三、脂联素对分子Akt、ERK磷酸化的影响以100ng/ml的脂联素刺激人卵巢癌细胞株Caov3和SKOV3细胞后,在不同时间(0分,10分,30分,60分)收集细胞,并采用Western Blotting法分析比较Caov3和SKOV3细胞的信号分子Akt、ERK的磷酸化。观察脂联素对抑制剂LY294002和PD98059处理后的卵巢癌细胞增殖与凋亡的影响1、分别以Akt分子上游蛋白PI3K的抑制剂LY294002和ERK分子上游蛋白MEK的抑制剂PD98059处理人卵巢癌细胞株Caov3和SKOV3细胞1小时,再用100ng/ml脂联素处理,采用MTT比色法观察不同时间(24,48,72小时)细胞在脂联素刺激后的增殖情况。2、采用Western Blotting法分析比较Caov3细胞5个组(未处理组、H_2O_2(50μM)处理组、H_2O_2(50μM)+100ng/ml脂联素处理组、H_2O_2(50μM)+LY294002+100ng/ml脂联素组、H_2O_2(50μM)+PD98059+100ng/ml脂联素组)的细胞周期蛋白Cyclin B及凋亡相关蛋白caspase3、Bax的蛋白表达水平。同法分析比较SKOV3细胞5个组的细胞周期蛋白Cyclin B及凋亡相关蛋白caspase3、Bax的蛋白表达水平。结果:1.FIGOⅠ-Ⅳ期的卵巢癌患者血清脂联素浓度均显著高于正常志愿者血清浓度(p0.05)。而FIGOⅣ期的卵巢癌患者血清脂联素浓度显著高于FIGOⅠ期的卵巢癌患者(p0.05),其他FIGO分期的卵巢癌患者血清脂联素浓度间无显著性差异(p0.05)2.FIGOⅢ-Ⅳ期的卵巢癌患者血清脂联素浓度均低于腹水脂联素浓度(p0.05)。3.Caov3和SKOV3细胞均有AdipoR1的mRNA和蛋白表达,且在SKOV3细胞的表达强于Caov3细胞(p0.05)。4.以不同浓度的脂联素刺激后,Caov3和SKOV3细胞的细胞存活率均有明显的增加,且呈剂量依赖性。而以100ng/ml的脂联素刺激后,在不同的时间点(24,48,72小时),脂联素刺激组的细胞数量明显增加。5.Caov3和SKOV3细胞在以100ng/ml的脂联素刺激后,Cyclin B的mRNA和蛋白表达水平均明显上升(p0.01)6.以H_2O_2(50μM)处理Caov3和SKOV3细胞时,可以观察到Caov3和SKOV3细胞的caspase 3、Bax的蛋白表达水平均有明显上调,而在脂联素处理后,caspase3、Bax的蛋白表达水平下降。7.Caov3和SKOV3细胞在受脂联素刺激后,p-Akt表达上升,Caov3细胞在第30分钟,SKOV3细胞在第10分钟p-Akt的表达最强。而p-ERK的表达也出现了上调,Caov3细胞在第60分钟,SKOV3细胞在第30分钟p-ERK的表达最强。8.在外源性脂联素(100ng/ml)刺激不同时间(24,48,72小时)后,Caov3和SKOV3细胞数量均有明显的增加(p0.05)。LY294002+脂联素处理组和PD98059+脂联素处理组的细胞增殖在48和72小时显著低于脂联素刺激组(p0.05),在24小时没有显著性差异。同时还观察到,H_2O_2(50μM)诱导Caov3和SKOV3细胞凋亡后,脂联素刺激可以上调细胞周期蛋白Cyclin B的蛋白表达水平,而再以LY294002和PD98059处理后,脂联素的上调作用受到了抑制。9.H_2O_2(50μM)诱导Caov3和SKOV3细胞凋亡后,细胞凋亡蛋白caspase3、Bax的蛋白表达水平上升,而脂联素可以抑制细胞凋亡蛋白caspase3、Bax的蛋白表达水平的上升,而再以LY294002和PD98059处理后,脂联素的抑制作用受到了拮抗。结论:1、卵巢癌患者血清脂联素水平低于腹水中脂联素水平,但是高于健康者的血清脂联素水平。2、脂联素可以促进卵巢癌Caov3和SKOV3细胞的增殖。3、脂联素可以激活卵巢癌细胞的PI3K-Akt、Raf-MEK-ERK途径,进而抑制肿瘤细胞的凋亡,促进肿瘤细胞增殖。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.31;R730.44
【部分图文】：

细胞,博士学位论文,琼脂糖凝胶电泳

Caov3、SKOV3细胞AdipoR1的mRNA转录及PCR产物的琼脂糖凝胶电泳

蛋白表达,细胞的,细胞,琼脂糖凝胶

ov3、SKOV3细胞AdipoR1的mRNA转录及PCR产物的琼脂糖凝胶电CR检测Caov3、SKOV3细胞中的AdipoR1的mRNA转录，以AdipoRSKOV3细胞AdipoR1的mRNA转录水平的差异，* p <0.05。

卵巢癌细胞,细胞,癌细胞

图3.3 MTT法观察不同时间点卵巢癌细胞增殖。相比，在不同时间点（24、48、72小时），脂联素刺激组的细胞数量均。脂联素可以促进Caov3、SKOV3细胞的增殖。表3.3 度脂联素刺激卵巢癌细胞后MTT法测得的OD值（X±SD）。Caov3 细胞 SKOV3 细胞0.187±0.020 0.166±0.0100.261±0.022 0.231±0.0100.453±0.018 0.453±0.0260.589±0.026 0.642±0.033 0.777±0.034 0.710±0.034 0.916±0.040 0.956±0.026

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