介孔有机硅中空纳米球固定尿酸酶检测尿酸的研究

发布时间：2020-09-11 15:04

　　研究目的:近年来由于尿酸堆积在人体内而引起的痛风等疾病越来越影响人们的身体健康和日常生活,因此及时对体内尿酸进行检测对预防和治疗痛风、高尿酸血症等疾病非常必要。目前检测尿酸的常用方法主要有高效液相色谱法、同位素稀释质谱法、酶法等,前两种检测方法存在操作复杂、仪器昂贵、检测周期长等缺点,不适于尿酸的快速检测。而酶法检测尿酸通过尿酸酶催化生成尿囊素,生成的产物与底物浓度成正比,通过测定尿囊素的吸光度值,计算尿酸的浓度,酶法检测具有特异性好、准确度高等优点,但尿酸酶对反应条件要求高,无法回收继续利用,故而采用酶固定化技术,利用介孔有机硅中空纳米球固定尿酸酶对血清尿酸进行测定。研究方法:通过典型的Stober法合成SiO_2纳米球,用SiO_2纳米球作为硬模板通过一步生长诱导腐蚀法合成介孔有机硅中空纳米球。使用扫描电镜对合成的SiO_2纳米球进行表征,使用扫描电镜、透射电镜、氮气吸附、红外光谱、热重分析对合成的介孔有机硅中空纳米球和固定尿酸酶后的介孔有机硅中空纳米球进行表征。用合成好的介孔有机硅中空纳米球对尿酸酶进行固定,使用正交试验选出固定尿酸酶的最佳条件。通过单因素试验选择检测尿酸的最佳的反应时间和最适的载体-尿酸酶量,在最佳的反应条件下,用介孔有机硅中空纳米球固定后的尿酸酶检测尿酸,因为生成的尿囊素与尿酸成正比,所以通过测定290 nm处的尿囊素吸光度值,计算尿酸浓度。研究结果:SEM和TEM结果表明,合成的介孔有机硅中空纳米球平均尺寸为380 nm且每个球都是中空的,中空空腔为230 nm,同SiO_2纳米球的粒径大小一致。SiO_2纳米球和介孔有机硅中空纳米球均分散良好。介孔有机硅中空纳米球的BET比表面积和孔容分别为592.1 m~2/g和0.29 cm~3/g,介孔有机硅中空纳米球固定尿酸酶后的BET比表面积和孔容分别为47.89 m~2/g和0.059 cm~3/g。介孔有机硅中空纳米球和固定尿酸酶后的介孔有机硅中空纳米球孔径均为2 nm。热重分析结果显示在100℃~400℃之间,介孔有机硅中空纳米球样品失重约3%,而介孔有机硅中空纳米球固定尿酸酶后失重达7%,在400℃以上,介孔有机硅中空纳米球和固定尿酸酶的介孔有机硅中空纳米球都迅速失重,且在400℃~900℃,失重达7%左右,这部分失重是因为桥连的有机硅烷基团。尿酸酶的最佳固定时间为8小时,加入的最适尿酸酶体积为2 mL,在最佳固定条件下,尿酸酶的平均固定率在90%以上,固定后尿酸酶的活性与游离酶相比能保持在90%以上。固定后尿酸酶最适的反应温度为40℃,在70℃时尿酸酶的活性仍保持40%以上,最适的pH为8.5,在pH=7-11间较稳定。4℃保存3个月后,固定尿酸酶活性与最初相比仍保持90%以上,固定后的尿酸酶检测尿酸,重复使用30次后活性仍剩余70%以上,检测血清尿酸重复使用40次活性才丧失。通过单因素试验选择检测尿酸的最佳的反应时间和最适的载体-尿酸酶量,最佳反应时间为20 min,加入的最适载体-尿酸酶量为3 mg。在最佳的反应条件下,用介孔有机硅中空纳米球固定后的尿酸酶检测尿酸,通过测定尿囊素在290nm处的吸光度值,计算尿酸浓度。血清尿酸检测在0.01 mg/mL~1.0 mg/mL的范围内线性良好,检测限为0.0039 mg/mL,回收率在93.4%~96.2%之间,其日内变异率在2.52%~3.05%之间,日间变异率在5.20%~6.87%之间。本法对血清尿酸进行检测的结果与标准的尿酸酶紫外法检测尿酸的结果进行独立样本的T检验,t=0.007,df=16,p=0.995,p0.05,介孔有机硅中空纳米球固定尿酸酶检测尿酸与游离尿酸酶的检测结果没有差异。对尿酸检测结果进行干扰试验,尿素、胆红素和胆酸钠对尿酸检测没有干扰影响,而抗坏血酸对尿酸检测结果有干扰。研究结论:1.通过Stober法合成了单分散的SiO_2纳米球,以其作为硬模板通过一步生长诱导腐蚀法合成了内部具有中空空腔,孔径均一可调、比表面积大、分散性好的介孔有机硅中空纳米球。2.成功地使用介孔有机硅中空纳米球固定了尿酸酶,并对固定后的酶学性质进行了测定,介孔有机硅中空纳米球固定的尿酸酶pH稳定性和热稳定性良好,酶活性和结构未改变。3.建立了介孔有机硅中空纳米球固定尿酸酶检测尿酸的方法,在20 min内可以完成对尿酸的检测,该法准确度高,重复性好,固定后的尿酸酶检测尿酸后经过离心沉淀后仍可重复使用。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R446.1;Q814.2

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