miRNA-145-5P通过下调Smad3加重脓毒症炎性肺损伤

发布时间：2020-09-11 17:54

　　研究背景脓毒症(sepsis)是临床常见危重症,其发病率高、进展凶险、死亡率高,是重症监护室患者死亡最常见的原因之一。脓毒症过度炎症反应可诱发多器官功能障碍,其中肺是最先、最易受累脏器。脓毒症相关炎性肺损伤中,临床最多见的是ARDS【Acute Respiratory Distress Syndrome,急性呼吸窘迫综合征】,常以急性呼吸衰竭伴进行性低氧血症、弥漫性肺浸润为特征。ARDS通常由导致全身炎性反应的疾病诱发,其中脓毒症是最常见的间接致病因素。ARDS病死率高,即便是在重症监护技术高度发展的今天,ARDS病死率仍高达40%左右,表明其仍旧是威胁人类生命的一类重要疾病。与非脓毒症所致的ARDS相比,脓毒症诱发的ARDS损伤程度更严重、预后更差、拔管成功率更低、死亡率更高。因此,进一步探究脓毒症肺损伤的发生机制、明确疾病进展的关键过程和重要作用靶点,进而提出精准的分子治疗方案,将具有极为重大的医学和社会意义。我们研究发现:Smad3基因敲除小鼠的全身抗损伤能力显著降低,表现为肺等重要脏器对LPS的敏感性显著增高,肺组织水肿加重、出血增多,脓毒症相关肺损伤严重程度和死亡率均显著升高。通过对脓毒症患者与健康者的外周血进行高通量测序,逐步筛选得到差异表达且可能靶向Smad3的两种miRNAs:miR-145-5p、miR-744-5p。为进一步深入探究miR-744-5p、miR-145-5p在脓毒症炎性肺损伤中的作用及机制,我们选用小鼠作为实验对象,分别从体内、体外两部分展开研究。第一部分构建LPS诱导的炎性肺损伤动物模型及细胞模型目的:构建LPS诱导的炎性肺损伤动物模型模拟体内脓毒症肺组织炎性损伤,构建LPS诱导的炎性肺损伤细胞模型模拟体外肺上皮细胞炎性损伤。方法:LPS诱导的炎性肺损伤动物模型:不同浓度梯度LPS(脂多糖,Lipopolysaccharides)腹腔注射诱导C57BL/6小鼠脓毒症肺组织炎性损伤,观察并记录肺脏大体形态、肺组织切片染色、湿干重比评估肺组织损伤情况,RT-PCR检测肺组织IL-1(白细胞介素-1,Interleukin-1)、TNF-a(肿瘤坏死因子-α,Tumor Necrosis Factor-α)表达量。LPS诱导的炎性肺损伤细胞模型包括LPS直接刺激肺上皮细胞模型和LPS-单核/巨噬细胞-肺上皮细胞间接刺激模型。前者采用不同浓度梯度LPS直接加入至小鼠肺上皮细胞株MLE-12培养基中,后者先将LPS加入小鼠单核/巨噬细胞株RAW264.7培养基中而后采集其细胞上清加入至MLE-12培养基中。RT-PCR检测细胞IL-1、TNF-a表达量,CCK-8检测细胞增殖,流氏检测细胞凋亡。结果:(1)LPS诱导的炎性肺损伤动物模型:与对照组相比,LPS腹腔注射小鼠肺组织出血增加,肺水肿加重;肺组织HE染色出血增加,肺泡破坏加重,间质增厚,炎性细胞浸润增多;肺组织IL-1及TNF-a mRNA表达量升高。(2)LPS诱导的炎性肺损伤细胞模型:LPS直接刺激肺上皮细胞模型中,1ug/ml-10 ug/ml LPS对MLE-12的炎性介质产生、增殖和凋亡均无明确影响。LPS-单核/巨噬细胞-肺上皮细胞间接刺激模型中,LPS刺激RAW264.7后,细胞IL-1和TNF-a炎性介质的mRNA表达量显著升高,将LPS刺激后的RAW264.7细胞上清加入至MLE-12培养基后,MLE-12增殖速度显著降低,凋亡比例明显升高,但其细胞死亡比例无显著变化。结论:(1)腹腔注射LPS可成功构建LPS诱导的炎性肺损伤动物模型(2)LPS直接诱导MLE-12不能构建LPS诱导的炎性肺损伤细胞模型;(3)LPS诱导RAW264.7分泌炎性介质可间接损伤MLE-12,从而构建LPS诱导的炎性肺损伤细胞模型。第二部分miRNA与LPS诱导的炎性肺损伤相关性验证及因果关系探究目的:验证高通量测序筛得的miR-744-5p、miR-145-5p与脓毒症肺损伤的相关性,并进一步验证二者之间的因果关系。方法:RT-PCR检测LPS诱导的炎性肺损伤动物模型及细胞模型中miR-744-5p、miR-145-5p的表达量;转染miRNA mimic上调miRNA在细胞内的表达,转染miRNA inhibitor下调miRNA在细胞内的表达,RT-PCR检测miRNA、IL-1、TNF-a表达量,CCK-8检测细胞增殖,流氏检测细胞凋亡。结果:(1)miR-744-5p在LPS诱导的炎性肺损伤动物和细胞模型表达量均降低,但表达量改变未呈现明确LPS剂量相关性;(2)miR-145-5p在LPS诱导的炎性肺损伤动物和细胞模型表达量均升高,且表达量改变呈现LPS剂量依赖性;(3)转染miR-744-5p和miR-145-5p的miRNA mimic可上调miRNA在细胞内的表达;(4)转染miR-744-5p和miR-145-5p的miRNA inhibitor可下调miRNA在细胞内的表达;(5)转染随机序列与转染miR-744-5p mimic的RAW.264.7细胞相比,两种细胞对相同剂量LPS诱导的IL-1、TNF-a表达增加效应无明显差异;采集相同剂量LPS刺激后的两种RAW.264.7细胞上清用于培养MLE-12,两种上清对MLE-12炎性损伤程度也无明显差异;(6)转染随机序列与转染miR-145-5p mimic的RAW.264.7细胞相比,相同剂量LPS刺激条件下,转染miR-145-5p mimic的RAW.264.7细胞IL-1和TNF-a表达增加程度更高;相同剂量LPS刺激两种细胞后,转染miR-145-5p的RAW.264.7细胞上清对MLE-12炎性损伤程度也更重;(7)相反,与转染随机序列的RAW.264.7细胞相比,转染miR-145-5p inhibitor的RAW.264.7细胞在相同剂量LPS刺激下,诱导合成的炎性介质IL-1、TNF-a表达增加水平被降低;相应的,细胞上清诱导的MLE-12炎性损伤程度也被减弱。结论:(1)miR-744-5p、miR-145-5p这两种miRNAs均与LPS诱导的炎性肺损伤存在相关性;(2)过表达miRNA-145-5p加重LPS诱导的肺上皮细胞炎性损伤,呈现LPS高反应性;下调miRNA-145-5p减轻LPS诱导的肺上皮细胞炎性损伤,呈现LPS低反应性;提示miRNA-145-5p与LPS诱导的肺上皮细胞炎性损伤关系更为密切,故筛选为下一步实验的研究对象。第三部分下调Smad3加重LPS诱导的炎性肺损伤目的:在细胞水平验证下调Smad3可加重LPS的炎性肺损伤效应方法:转染si-RNA抑制巨噬细胞内Smad3的表达与活化,RT-PCR检测Smad3、IL-1、TNF-a表达量,Western Blot检测Smad3/P-Smad3蛋白表达量,CCK-8检测细胞增殖。结果:(1)转染Smad3 si-RNA可下调巨噬细胞内Smad3的mRNA表达水平、蛋白质表达水平与磷酸化程度;(2)转染Smad3 si-RNA与转染随机序列的RAW264.7细胞相比,相同LPS刺激可显著增加前者IL-1、TNF-a的mRNA表达量;(3)在相同LPS刺激下,转染Smad3 si-RNA的RAW264.7细胞上清对MLE-12炎性损伤程度更重。结论:下调Smad3可加重LPS诱导的炎性肺损伤。第四部分miR-145-5p通过下调Smad3加重LPS诱导的炎性肺损伤目的:(1)验证miR-145-5p可下调Smad3表达;(2)验证miR-145-5p加重LPS诱导的炎性肺损伤的效应由Smad3介导。方法:转染miRNA mimic实现miRNA在细胞内的高表达,转染miRNA inhibitor下调miRNA在细胞内的表达,转染si-RNA抑制巨噬细胞内Smad3的表达与活化,RT-PCR检测Smad3、IL-1、TNF-a表达量,cck8检测细胞增殖,流氏检测细胞凋亡。结果:(1)转染miRNA-145-5p inhibitor可提高Smad3的mRNA、蛋白及磷酸化水平;(2)转染Smad3 si-RNA后,过表达miR-145-5p mimic诱导的LPS高反应性和下调miR-145-5p诱导的LPS低反应性均被阻断。结论:(1)miRNA-145-5p可下调Smad3表达;(2)miRNA-145-5p通过下调Smad3加重LPS诱导的炎性肺损伤;(3)抑制miR-145-5p通过上调Smad3表达进而减轻LPS诱导的炎性肺损伤。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R459.7
【部分图文】：

韦恩图,数据库,靶向,语言分析

miRNA-145-5P 通过下调 Smad3 加重脓基于 Gene Ontology 数据库采用 R 语言分析 miRNA 候选靶功能，筛选与炎症免疫生物功能相关联的 miRyclopedio 数据库采用 R 语言分析候选 miRNA 靶基因集合参找参与免疫炎症相关信号通路的 miRNAs。我们进一步将 m种；4. 为了从中筛选出与Smad3高度相关的miRNAs, 我们利rgetScan 三大数据库对这 162 种 miRNAs 进行靶基因预测分 Smad3 的 miRNAs，共计 23 种（图 1-1）。

可能性,数据库,靶向,序列分析

图 1-2 miR-145-5p 在 Targetscan(A)/miRDB(B)数据库中靶向 Smad3 的 miRNAs 可能性排序居前列，miR-744-5p在 Targetscan(C)数据库中靶向 Smad3 的 miRNAs 可能性排序居前列，D：miR-744-5p、miR-145-5p 靶向 Smad3序列分析为进一步深入探究 miR-744-5p、miR-145-5p 在脓毒症炎性肺损伤中的作用及机制，我们拟从动物和细胞两个维度展开研究。分别探索构建 LPS 诱导的炎性肺损伤动物模型和细胞模型模拟脓毒症肺组织炎性损伤，并对模型进行验证。

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实验结果一、构建并验证 LPS 诱导的炎性肺损伤动物模型（一）LPS 腹腔注射法诱导小鼠炎性肺损伤为了构建 LPS 诱导的炎性肺损伤动物模型，进而模拟脓毒症肺组们通过查阅文献拟采用经典的 LPS 腹腔注射法构建小鼠脓毒症模型，脏大体形态观测、肺组织切片染色、肺组织分子水平三个维度验证是拟脓毒症肺组织炎性损伤。依据文献，我们采用 3 组 LPS 浓度（15 mg/kg、20 mg/kg）诱导疾病发生。（二）LPS 诱导的炎性肺损伤动物模型肺组织损伤明与对照组相比，脓毒症小鼠肺组织大体观可见出血增加，水肿加重（干重比明显增加，提示脓毒症导致肺组织水肿加重（图 1-4）；组织学肺组织充血增加，肺泡破坏加重，肺间质增厚，炎性细胞浸润增多（图

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