DNA稳定荧光金属纳米探针结合靶循环放大用于microRNA检测研究

发布时间：2020-09-14 16:48

　　 微小核糖核酸(miRNA)作为一类重要的内源性调控型核酸分子和疾病标志物,实现其灵敏而特异的分析对于生命活动机理的阐释以及临床疾病的诊断和治疗等都具有非常重要的意义。而传统的基于有机荧光染料分子标记探针作为信号输出的miRNA检测方法大都面临光稳定性差、寿命短、易漂白、生物毒性大等问题。近年来,随着纳米技术的快速发展,一系列新型荧光纳米探针不断涌现并展示出光学性质稳定、荧光强度高、尺寸可调、易于修饰和功能化改性等诸多优点。其中,DNA稳定的荧光金属纳米簇,因兼有生物水溶性好、生物毒性低、操作简单、设计灵活等优势,目前已作为一种极具应用前景的新型免标记荧光探针,在生化分析领域吸引了极大的关注和研究热情。尤其是以核酸为合成模板的特点,使得DNA稳定荧光金属纳米簇与核酸放大技术的结合非常便利,从而为开发miRNA这类在实际体系中表达丰度极低的靶物质分析方法提供了新契机。基于此,本论文即以发展高选择性和高灵敏度的新型miRNA检测方法为目标,分别选择末端转移酶介导的“超长”poly T稳定荧光铜纳米颗粒和以富含胞嘧啶DNA单链为模板介导合成的高强度荧光银纳米簇为信号输出源,通过分别结合氧化石墨烯-DNase Ⅰ靶循环放大策略和催化发夹自组装放大机制,系统开展了基于DNA稳定荧光金属纳米簇结合靶循环放大策略的miRNA分析研究。具体包括以下研究内容:1.基于“超长”poly T稳定荧光铜纳米颗粒结合石墨烯-DNase Ⅰ靶循环放大机制的miRNA免标记检测通过巧妙结合具有单双链核酸可控吸附性能和酶切保护作用的氧化石墨烯(GO)、能选择性剪切DNA的脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ)以及末端转移酶(TdT)介导的“超长”polyT稳定荧光铜纳米颗粒(superlongpolyT-CuNPs)分析平台,成功发展了一种简单、精准、高选择性的miRNA免标记、放大检测新方法。在该方法中,GO可将与靶miRNA完全互补的DNA捕获探针吸附于表面,在靶标存在时,miRNA和DNA通过碱基配对形成双链。由于GO对双链核酸吸附能力较弱,miRNA-DNA双链可以从GO表面解脱下来进入溶液中。加入DNase Ⅰ后,DNase Ⅰ可选择性将该双链中的DNA剪切成多条片段,进而使miRNA重新释放并进入下一个循环中。反应结束后,通过离心去除GO并提取上清液,加入TdT和dTTP溶液进行poly T聚合。所获得的超长poly T产物即可作为模板,在Cu2+和抗坏血酸的作用下合成荧光铜纳米颗粒,进而实现miRNA的检测。选择let-7a作为模式靶标,荧光分析和电泳表征都证实该方法具有很好的循环放大分析可行性,并在50 pM-10nM范围内显示出良好的线性相关性,实际检测限达到50 pM。同时,选择五组对照miRNA进行实验发现,该方法对于let-7a的分析具有较好的选择性,并可成功用于血清样品中靶miRNA的检测,为发展新型免标记miRNA检测方法提供了新思路。2.基于DNA稳定银纳米簇激活式荧光探针结合催化发夹自组装技术的miRNA循环放大检测研究利用本课题组发现的具有高强度荧光输出的DNA稳定银纳米簇(DNA-AgNCs)作为信号源,通过引入标有淬灭基团BHQ1的DNA封闭探针,成功构建了一种激活式荧光探针,其荧光淬灭效率和激活效率分别高达90%和92%。在此基础上,进一步结合催化发夹自组装(CHA)放大技术,巧妙地将靶标设计为CHA反应的触发链,发展了一种miRNA循环放大检测新方法。在该方法中,具体设计了 H1和H2两个发夹探针,H1将可激活DNA-AgNCs激活式荧光探针的DNA序列封闭于茎部结构中,H2则负责实现靶标的循环利用。在靶标不存在时,H1、H2由于本身二级结构的稳定性,不能相互杂交,CHA反应不会进行,从而没有信号激活发生;在靶标存在时,miRNA通过碱基配对打开H1,进而H1暴露的另一端又将H2打开并形成H1-H2杂交双链,与此同时,靶标被释放并进入下一个循环。由于CHA反应产物H1-H2杂交双链可有效激活DNA-AgNCs激活式荧光探针,该荧光信号的输出即可指示靶标的存在和含量。于是,在对CHA体系序列、缓冲液体系以及激活式荧光探针的序列和比例等条件进行系统优化后,选择miRNA-21作为模式靶标,通过荧光分析和电泳实验证实了该方法可成功实现对靶miRNA的高选择性循环放大检测。该方法具有操作简单、免酶、免洗等优点,尤其通过DNA稳定银纳米簇的引入,有望为miRNA的高选择性和高灵敏度分析提供一个新的平台。
【学位单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R440;O657.3
【部分图文】：

以ＤＮＡ为模板成功介导合成ＡｕＮＣｓ的报道相对较少。Ｚｈｏｕ１４８］等报道了在超声作逡逑用下利用双链ＤＮＡ和刻蚀成单原子分散的金纳米晶体合成具有荧光的八１：８的方逡逑法；以！１１１￡（＾［４９］等（图１．１）证明了以柠檬酸盐为还原剂，？0１丫（：和？０以八分别在逡逑ｐＨ＝３，邋Ｃ３0：Ａｕ＝ｌ：２和ｐＨ＝６－７，Ａ３0：Ａｕ＝ｌ：３０的条件下均可以很好的合成蓝色的劳逡逑光ＡｕＮＣｓ；邋ＩＶ５０］等以２３个碱基的特定ＤＮＡ序歹ＩＪ作为模板，二甲胺硼烷为还原逡逑剂合成了红色ＡｕＮＣｓ。在进一步研宄后发现多种发夹ＤＮＡ分子也可以作为合成逡逑４逡逑

ＤＮＡ稳定荧光铜纳米颗粒的合成模板有两种，一种是双链ＤＮＡ邋（ｄｓＤＮＡ），逡逑一种是单链ＤＮＡ邋（ｓｓＤＮＡ），但还原剂均为抗坏血酸。ｄｓＤＮＡ随机序列可以作为逡逑介导合成ＣｕＮＰｓ的模板是由？＾0处丨１＂［５８］等（图１．４）邋２０１０年首次发现的，并且证逡逑明了合成的ＣｕＮＰｓ的荧光强度随着模板双链ＤＮＡ长度的增加而增强，但单链及逡逑三重ＤＮＡ和双链肽核酸则不具备该功能。自此以后，打开了利用ＤＮＡ为模板介逡逑导合成荧光铜纳米颗粒研究的大门。逡逑Ｃｕ°逡逑Ｉ．．．．．．ｉｉ．．．．．．ｉ．ｉ．邋ｉ．Ｉ．．．．．．．Ｃｕ２＊邋ｎＴＴＴＴＴＴｌ逡逑ＬＬＬＵ邋ａｓｃｏｒ＾ｔｅ邋ＬＪＪＪＪ逡逑Ｃｕ°逡逑Ｉ邋ｌ邋ｌ邋ｌ邋ｌｌ邋１邋ｌ邋ｌ邋Ｉ邋ｉ邋ｌ邋ｌ邋Ｃｕ２、Ｉ邋ｌ邋Ｊ邋uk邋ｉ邋■邋ｉ邋ｌ邋■邋｜邋｜邋｜邋｜逡逑Ｉ邋１邋１邋１逦？，．Ｊ邋ａｓｃｏｒｂａｔｅ邋ＬＪ．－ＬＬ．ＬｌＩ．邋■丨逡逑Ｃ．．２＋逡逑ｉ邋ｔ邋Ｍ邋Ｉ邋ｉ邋ｔ邋Ｉ邋ｔ逦￣￣＾逦ｎｏ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ逡逑ａｓｃｏｒｂａｔｅ逡逑图１．４以双链ＤＮＡ随机序列为模板合成荧光铜纳米颗粒［５８］逡逑后来，本课题组的Ｑｉｎｇ［５９，６（）］等（图１．５、图１．６）对此也进行了深入研宄，发逡逑现特殊序列的ｐｏｌｙ邋Ｔ单链及ｐｏｌｙＡＴ／ＴＡ双链也可以作为合成荧光ＣｕＮＰｓ的模板，逡逑并且发现了合成的焚光ＣｕＮＰｓ的突光强度与ｐｏｌｙ邋Ｔ及ｐｏｌｙ邋ＡＴ／ＴＡ的长度成正比。逡逑这一发现极大丰富了合成ＣｕＮＰｓ的ＤＮＡ模板种类，并使得ＣｕＮＰｓ的应用前景更逡逑加广阔。逡逑－ｎ－Ｔ－ｒ－ｒ逦以。卿气逡逑Ｃｕ２＊逦Ｌ

ＤＮＡ稳定荧光铜纳米颗粒的合成模板有两种，一种是双链ＤＮＡ邋（ｄｓＤＮＡ），逡逑一种是单链ＤＮＡ邋（ｓｓＤＮＡ），但还原剂均为抗坏血酸。ｄｓＤＮＡ随机序列可以作为逡逑介导合成ＣｕＮＰｓ的模板是由？＾0处丨１＂［５８］等（图１．４）邋２０１０年首次发现的，并且证逡逑明了合成的ＣｕＮＰｓ的荧光强度随着模板双链ＤＮＡ长度的增加而增强，但单链及逡逑三重ＤＮＡ和双链肽核酸则不具备该功能。自此以后，打开了利用ＤＮＡ为模板介逡逑导合成荧光铜纳米颗粒研究的大门。逡逑Ｃｕ°逡逑Ｉ．．．．．．ｉｉ．．．．．．ｉ．ｉ．邋ｉ．Ｉ．．．．．．．Ｃｕ２＊邋ｎＴＴＴＴＴＴｌ逡逑ＬＬＬＵ邋ａｓｃｏｒ＾ｔｅ邋ＬＪＪＪＪ逡逑Ｃｕ°逡逑Ｉ邋ｌ邋ｌ邋ｌ邋ｌｌ邋１邋ｌ邋ｌ邋Ｉ邋ｉ邋ｌ邋ｌ邋Ｃｕ２、Ｉ邋ｌ邋Ｊ邋uk邋ｉ邋■邋ｉ邋ｌ邋■邋｜邋｜邋｜邋｜逡逑Ｉ邋１邋１邋１逦？，．Ｊ邋ａｓｃｏｒｂａｔｅ邋ＬＪ．－ＬＬ．ＬｌＩ．邋■丨逡逑Ｃ．．２＋逡逑ｉ邋ｔ邋Ｍ邋Ｉ邋ｉ邋ｔ邋Ｉ邋ｔ逦￣￣＾逦ｎｏ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ逡逑ａｓｃｏｒｂａｔｅ逡逑图１．４以双链ＤＮＡ随机序列为模板合成荧光铜纳米颗粒［５８］逡逑后来，本课题组的Ｑｉｎｇ［５９，６（）］等（图１．５、图１．６）对此也进行了深入研宄，发逡逑现特殊序列的ｐｏｌｙ邋Ｔ单链及ｐｏｌｙＡＴ／ＴＡ双链也可以作为合成荧光ＣｕＮＰｓ的模板，逡逑并且发现了合成的焚光ＣｕＮＰｓ的突光强度与ｐｏｌｙ邋Ｔ及ｐｏｌｙ邋ＡＴ／ＴＡ的长度成正比。逡逑这一发现极大丰富了合成ＣｕＮＰｓ的ＤＮＡ模板种类，并使得ＣｕＮＰｓ的应用前景更逡逑加广阔。逡逑－ｎ－Ｔ－ｒ－ｒ逦以。卿气逡逑Ｃｕ２＊逦Ｌ

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