电针激活μ-阿片受体缓解痛厌恶情绪的机制研究

发布时间：2020-09-18 12:17

　　 目的:根据国际疼痛协会的最新定义:疼痛是一种由组织损伤或潜在的组织损伤引起的相关感觉、情绪、认知和社会维度的痛苦体验,其中痛的情绪情感反应现在被认为是与感觉分辨不同的重要疼痛组成,尤其见于持续顽固性疼痛。前扣带皮层(ACC)脑区,特别是其吻侧部(rACC)被认为是情感回路的关键部分。许多研究表明,电针刺激可以缓解痛感觉,而我们之前的研究表明,电针刺激也可以缓解痛的厌恶情绪(痛情绪),但其机制目前尚不清楚。众所周知,电针刺激能激活内源性阿片系统来缓解痛感觉,因此我们推测,电针刺激可以通过激活rACC神经元上的μ-阿片受体减弱痛厌恶情绪。本研究将利用CFA诱导的慢性炎性痛刺激与可辨别的环境匹配所致的条件性位置回避模型,通过大鼠的行为学观察和在体多通道电生理记录rACC脑区神经元放电活动,结合western-blot蛋白检测,对电针刺激缓解慢性炎性痛所致的痛厌恶情绪进行探索。方法:1.建立CFA诱导的条件性位置回避模型(C-CPA)利用CFA诱导的慢性炎性痛刺激与特定的环境进行匹配,建立起条件性位置回避模型(C-CPA)。2.检测热缩足反射潜伏期(Paw Withdrawal Latency,PWL)先将热板温度升至50℃,然后把大鼠放进热板刺激仪内,观察大鼠出现缩足或者舔左侧脚掌的现象,并记录时间,重复三次,每次间隔15-20min,取三次记录数值的平均值。3.电针刺激大鼠脚掌注射完CFA/NS后,把针灸针扎入大鼠双侧环跳穴(GB30)位置上,将针灸针连接到电针仪,设定好参数打开电源进行电针刺激。4.在体多通道电生理技术观察大鼠厌恶情绪观察并记录给药前后rACC脑区神经元放电的活动。5.蛋白免疫印迹(western blot)取大鼠rACC脑区组织样本,应用western blot技术检测大鼠rACC内μ-阿片受体和NMDA受体三个亚基NR1、NR2A和NR2B的磷酸化水平。6.免疫荧光染色通过免疫荧光检测到rACC神经元上μ-阿片受体和NMDA受体的三个亚基NR1、NR2A和NR2B的共表达。结果:1.大鼠rACC内μ-阿片受体和NR1、NR2A、NR2B的共表达。通过免疫荧光检测到ACC神经元上μ-阿片受体和NMDA受体的亚基NR1、NR2A、NR2B分别共表达于同一神经元。2.CFA诱导的持续疼痛模型及条件性位置规避模型(C-CPA)的建立大鼠左侧脚掌注射CFA组与注射NS组相比较,注射CFA组大鼠PWL值在处理后第三天与第一天基础值相比显著缩短(P0.05);脚掌注射NS组,大鼠第三天在痛侧的停留时间和在第一天停留的时间相比无显著差异(P0.05),注射CFA组,大鼠第三天在痛侧的停留时间比第一天停留的时间显著缩短(P0.05),注射CFA组比注射NS组的回避分数大,差异有统计学显著性(P0.05)。3.电针刺激可以缓解CFA诱导的条件性位置回避(C-CPA)反应。假电针刺激组,大鼠第三天在痛侧的停留时间比第一天停留的时间显著缩短(P0.05),真电针刺激组,大鼠第三天在痛侧的停留时间和在第一天停留的时间相比无显著差异(P0.05),假电针刺激组比真电针刺激组的回避分数大,差异有统计学显著性(P0.05)。4.电针刺激不改变CFA引起的热痛行为。假电针(shamEA)刺激组与真电针(EA)刺激组,第三天测量大鼠的热痛行为反应,PWL值之间无显著差异(P0.05)。5.电针激活rACC内μ-阿片受体下调p-NR1、p-NR2A、p-NR2B的水平。真电针刺激组与假电针刺激组相比,μ-阿片受体蛋白表达量显著升高(P0.05),而p-NR1、p-NR2A、p-NR2B蛋白表达量显著降低(P0.05)。6.电针抑制CFA诱导rACC脑区痛侧放电频率升高的作用假电针刺激组,条件匹配后第三天痛侧与非痛侧相比,神经元放电频率显著增强(P0.05),真电针刺激组,条件匹配后第三天痛侧与非痛侧相比,差异无统计学显著性(P0.05)。7.ACC内注射μ-阿片受体拮抗剂CTOP反转了电针刺激减弱大鼠厌恶情绪的作用大鼠脚掌注射CFA/NS,在ACC内给予NS或者μ-阿片受体拮抗剂CTOP,再进行电针刺激。注射生理盐水组,大鼠第三天在痛侧的停留时间和在第一天停留的时间相比无显著差异(P0.05),注射CFA和生理盐水组,大鼠第三天在痛侧的停留时间和在第一天停留的时间相比无显著差异(P0.05),注射2 nmol/μl CTOP组,大鼠第三天在痛侧的停留时间和在第一天停留的时间相比无显著差异(P0.05),注射5/10/20 nmol/μl CTOP组,大鼠第三天在痛侧的停留时间比第一天停留的时间显著缩短(P0.05)且回避分数比其余两组明显增大,差异有统计学显著性(P0.05)。8.rACC内注射μ-阿片受体拮抗剂CTOP对p-NR1、p-NR2A、p-NR2B水平的影响真电针刺激组与假电针刺激组相比,p-NR1、p-NR2A、p-NR2B蛋白量显著降低(P0.05);注射5/10/20 nmol/μl CTOP组与注射NS组和2 nmol/μl CTOP组相比,p-NR1、p-NR2A、p-NR2B蛋白量显著升高(P0.05)。9.rACC内注射μ-阿片受体拮抗剂CTOP反转了电针抑制CFA诱导rACC脑区痛侧放电频率升高的作用注射生理盐水组,条件匹配后第三天痛侧与非痛侧相比,神经元放电频率无显著差异(P0.05),注射CFA和生理盐水组,条件匹配后第三天痛侧与非痛侧相比,神经元放电频率无显著差异(P0.05),注射低剂量2 nmol/μl CTOP组,条件匹配后第三天痛侧与非痛侧相比,神经元放电频率无显著差异(P0.05),注射5/10/20 nmol/μl CTOP组,条件匹配后第三天痛侧神经元放电频率与非痛侧相比显著增强(P0.05),且与其余两个组第三天的痛侧神经元放电频率相比,差异有统计学显著性(P0.05)。结论:大鼠脚掌注射CFA引起rACC脑区p-NR1、p-NR2A和p-NR2B水平增高是神经元放电活动增强的基础,而后者又是产生CPA反应的原因,引起大鼠的痛情绪;给予电针刺激,激活了rACC脑区μ-阿片受体后,NR1、NR2A和NR2B的磷酸化水平随之降低,从而逆转了神经元电活动和大鼠CPA反应的增强,抑制了痛厌恶情绪的发生。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R402
【部分图文】：

山西医科大学硕士学位论文置回避（CPA）装置介绍et al[20]和 Zhang Y et al[21]的设计结合本实验室的条件见图 1。一无盖无底的长盒（60cm×15cm×25cm），将长框平均分成两个室，一侧室贴有蓝色竖条纹，一的钢丝网眼孔一侧较疏松，一侧较密集，可使大鼠对行的过程中，装置外悬挂一个 LED 灯，能够使其中之分。装置外安装有摄像头，并与电脑连接，记录大

底部的钢丝网眼孔一侧较疏松，一侧较密集，可使大鼠对两室进行辨别区分。实验进行的过程中，装置外悬挂一个 LED 灯，能够使其中一室与另一室的光线有明暗之分。装置外安装有摄像头，并与电脑连接，记录大鼠在两室停留的时间。图 1 CPA 装置实物图(2)CPA 行为训练过程C-CPA 训练过程分三天进行，见图 2：

行为学和蛋白印迹的数据采用均数±标准差（mean±SD）表示，电生理学数据不符合参数检验的要求，采用中位数（上四分位数，下四分位数）表示。行为学部分，同一组前后比较采用配对样本 T 检验，两不同组之间比较采用独立样本 T 检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。蛋白印迹部分，采用单因素方差分析（ANOVA）。电生理学部分，同一组前后对比采用 Wilcoxon符号秩和检验，两独立样本之间比较采用 Mann-Whitney 秩和检验，多重比较采用 LSD 分析。P<0.05 时，差异具有统计学显著性。2 结 果2.1.大鼠 rACC 内μ-阿片受体和 NR1、NR2A、NR2B 的共表达通过免疫荧光检测到rACC神经元上μ-阿片受体和NMDA受体的亚基NR1、NR2A、NR2B 分别共表达于同一神经元，见图 3。μ-opioid receptor MergeNMDA

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