基于低深度全基因组测序的平衡染色体重组检测方法的建立

发布时间：2020-09-27 10:20

　　流产是最常见的妊娠并发症之一,其中连续两次或两次以上的自然流产称为反复流产(recurrent miscarriage,RM)。自然流产的发生率高达妊娠总数的10%-15%,其中80%为早期流产。大量研究表明,遗传因素中的染色体异常对流产的发生有着非常重要的作用。染色体异常主要分为染色体数目异常和染色体结构异常。染色体数目异常有三体(如13三体,18三体和21三体)、三倍体及X单体等;染色体结构异常有染色体易位(translocations)和染色体倒位(inversions)等。对于遗传物质没有增加或者减少的染色体结构异常,可以称为平衡染色体重组(balanced chromosomal rearrangements)。这类染色体结构异常主要包括染色体易位和染色体倒位。由于遗传物质没有增加或者减少,因此它们的携带者一般都具有正常的表型。但是当这些携带者与正常人结婚之后尝试生育下一代会出现如反复流产这样的生育问题。目前它们主要通过传统的方法进行检测,如G带核型分析(G-banding karyotype)。但是这些传统的方法都有各自的不足和局限。本研究利用双末端低深度全基因组测序(whole genome sequencing)的建库和测序方法,基于对测序数据自主研发的生物信息分析方法,可以使平衡染色体重组断点的检测分辨率达到单碱基的级别,从而突破传统检测方法的局限,为临床解释提供更精确的结果。研究结果如下:1.本研究在千人基因组的样品中检测到4例染色体易位,样品编号为HG02260,HG03729,NA18612和NA20764,分别是秘鲁人(美洲),泰卢固人(南亚),中国人(东亚)和托斯卡纳人(欧洲)。HG02260的9号染色体长臂和14号染色体长臂发生同臂易位,HG03729的3号染色体长臂和17号染色体短臂发生异臂易位,NA18612的16号染色体长臂和17号染色体长臂发生同臂易位,NA20764的2号染色体短臂和19号染色体短臂发生同臂易位。2.同时还在千人基因组的数据中检测到4例倒位的样品,样品编号为NA20759,HG04152,NA18959和NA21133,分别是托斯卡纳人(欧洲),孟加拉人(南亚),日本人(东亚)和古吉拉特人(南亚)。NA20758在2号染色体的短臂发生了一个超过13MB大小的倒位,HG04152在1号染色体长臂发生了一个接近4MB大小的倒位,NA18959在3号染色体的长臂发生了一个约217KB大小的倒位,而NA21133就在X染色体的短臂发生了一个约58KB大小的倒位。3.本研究从Coriell研究所获得了这8个样品的细胞系,通过PCR和sanger测序,所得到的结果与低深度全基因组测序结果一致,成功验证了上述千人基因组的易位和倒位。同时,也对HG02260,HG03729,NA18612,NA20764和NA20759这5个样品的细胞系进行G带核型分析,并成功验证。而另外3个倒位的片段是小于5MB的(HG04152,NA18959,NA21133),在核型结果中无法检测,因此这3个样品将不进行G带核型验证。4.本研究从合作方获得了77例已经有G带核型分析结果的反复流产患者的DNA样品,经过DNA质控,建库,测序和生物信息分析之后,与G带核型分析结果进行比较。发现其中的59例的低深度全基因组测序检测结果是和G带核型分析结果一致;有10例低深度全基因组测序结果为正常而G带核型分析结果为异常;剩下8例在低深度全基因组测序结果中为异常而G带核型结果为正常。大部分的样品(59/77=76.62%)在低深度全基因组测序结果和G带核型结果是一致的,说明低深度全基因组测序有替代传统方法的潜力。而由于目前测序长度的限制有10例样品没有在低深度全基因组测序中的结果检出。另外有8例样品在低深度全基因组测序结果中为异常而在G带核型结果中为正常,主要原因为发生平衡染色体重组的片段长度相近并且条带类似,G带核型分析比较难以进行检测并且容易漏检。总之,随着将来测序技术的发展和进步,测序的长度将可以不断地提升,届时将可以不断完善目前测序技术中的不足,最后达到取代G带核型分析的金标准地位。
【学位单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R714.21;R440
【部分图文】：

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图 1-1 易位示意图色体上面有 2 个位置发生断裂，断裂的染色体片段颠倒 18断点的位置被称为倒位。根据发生倒位的染色体片段的位置acentric）和臂间倒位（pericentric），如果倒位只是发生在臂内倒位；如果发生倒位的片段包含了着丝粒，那么就称为保留了原有基因总数，对基因作用和个体发育一般无严重影生在基因的编码区或者其他重要的调控区域，就可能产生异

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图 1-2 倒位示意图（摘自网络）1.2 检测染色体重组相关技术1.2.1 G 带核型分析G 显带核型分析技术：目前的对染色体变异的检测手段，自从 70 年代高分辨率型分析手段开发应用后，鉴于其能够准确的可视化的诊断染色体异常的技术优势，目仍然是金标准的检测方法。G 显带核型分析技术是一种用于细胞遗传学的技术，通过色浓缩染色体产生可见的核型。它可用于通过整个染色体的照片表现来识别遗传疾中期染色体用胰蛋白酶处理（部分消化染色体）并用吉姆萨染色剂染色。异染色质往富含腺嘌呤和胸腺嘧啶（富含 AT）DNA 且相对基因贫乏，在 G 带中染色更暗。相较少浓缩的染色质（常染色质）往往富含鸟嘌呤和胞嘧啶（富含 GC）和更多转录活性结合较少的吉姆萨染色，并且这些区域在 G-带中显示为亮带。每一条染色体的长短臂端粒到着丝粒都会用数字编码条带模式，这种编号系统允许识别和描述染色体上的任

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本研究示意图

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