结核分枝杆菌PPK2核酸适配体的抗结核效果评价

发布时间：2020-09-27 18:09

　　目的探讨结核分枝杆菌多聚磷酸盐激酶2(PPK2)核酸适配体(aptamer)与体外结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)共培养来评估其抑菌效果。为开发新的高效、低毒的抗结核药物提供新的方向。方法1.运用生物信息学方法分析PPK2蛋白氨基酸序列与呼吸道部分常见病原菌同源性进行分析,并构建PPK2进化树。2.将PPK2核酸适配体与MTB标准株H_(37)Rv、卡介苗(BCG)、耻垢分枝杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌,通过酶联寡核苷酸分析(enzyme-linked oligonucleotide assay,ELONA)方法测定PPK2核酸适配体与H_(37)Rv结合亲和力,用相同的方法检测PPK2适配体与正常人、结核病人血清中PPK2蛋结合的亲和力。3.将PPK2核酸适配体加入不同浓度血清中共孵育24h,运用琼脂糖凝胶电泳分析其在不同浓度血清中的生物稳定性。4.采用微量刃天青显色法测定PPK2核酸适配体对H_(37)Rv的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)。5.将H_(37)Rv与1μmol/L的PPK2核酸适配体、随机序列接种到罗氏培养基,观察PPK2适配体与随机序列对H_(37)Rv生长影响。将H_(37)Rv与PPK2核酸适配体、突变体共培养10d,运用酶标仪测定D(600nm)值,观察PPK2核酸适配体对H_(37)Rv的生长影响。6.将H_(37)Rv与PPK2适配体共培养5周,采用结晶紫染色法观察PPK2适配体对MTB生物膜生长的影响。7.将PPK2核酸适配体与细胞共培养,观察核酸适配体对细胞毒性。结果1.生物信息学方法分析构建PPK2进化树显示H_(37)Rv的PPK2蛋白与呼吸道部分常见病原菌亲缘性较远,与铜绿假单胞菌亲缘关系相对较近。2.通过ELONA测定显示PPK2核酸适配体能与H_(37)Rv的PPK2蛋白选择性结合,在正常人与结核病病人血清中PPK2核酸适配体在结核病病人血清表现出较好的亲和力。3.琼脂糖凝胶电泳分析PPK2核酸适配体在血清中至少稳定存在8h。4.PPK2核酸适配体对结核分枝杆菌标准株H_(37)Rv的MIC为50nmol/L。5.罗氏培养基菌落生长显示PPK2适配体对H_(37)Rv生长具有抑制作用。生长抑制试验表明随着PPK2核酸适配体浓度增加H_(37)Rv的D(600nm)值呈现下降趋势,说明PPK2核酸适配体对H_(37)Rv生长存在抑制作用。6.PPK2核酸适配体与MTB共培养5周,经过结晶紫染色法测定显示PPK2核酸适配体影响MTB生物膜形成。7.细胞毒性试验显示高浓度与低浓度PPK2核酸适配体对细胞均无毒性。结论1.PPK2蛋白核酸适配体对体外H_(37)Rv表现出良好的抑菌活性。2.PPK2核酸适配体能够与结核病人血清PPK2蛋白选择性结合。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R446.5
【部分图文】：

进化树,蛋白,适配体,最大似然法

注：A. 邻接法；B. 最大似然法。图 1 PPK2 蛋白进化树Fig 1 PPK2 protein molecular phylogenetic tree2.2 ELONA 测定 PPK2 核酸适配体与 H37Rv 选择性结合

适配体,核酸,亲和力,分析测定

注：①P=0.002，②P=0.000。图 2 酶联寡核苷酸分析测定 PPK2 核酸适配体与几种常见菌株的亲和力ig 2 Affinity of PPK2 aptamer and several common bacterial strains detected by ELONA PPK2 核酸适配体与结核病人血清结合实验

适配体,血清,核酸,生物稳定性

注：P=0.0001酸分析测定 PPK2 核酸适配体与结核病人血清中 PK2 aptamer and PPK2 protein in serum of Tubercuby ELONA适配体的生物稳定性酸适配体在不同浓度血清中的生物稳定性，将、5%血清及无血清的稀释液中，经 3%琼脂糖见唯一清晰的特异性条带，在 24 h 见条带出配体在不同浓度血清中能稳定存在至少 8 h。

【参考文献】