叶酸代谢通路相关SNP位点检测方法的建立及其与先天性心脏病相关性的研究

发布时间：2020-09-29 15:39

　　第一部分建立多重四引物扩增受阻突变体系PCR方法同时检测四个叶酸代谢通路相关SNP位点目的:建立多重四引物扩增受阻突变体系PCR(M-T-ARMS-PCR)检测方法,实现单管一次性检测叶酸代谢通路相关的四个SNP位点:5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)C677T位点(rs1801133),A1298C位点(rs1801131),以及蛋氨酸合成酶(MS)A2756G位点(rs1805087)和蛋氨酸合成酶还原酶(MTRR)A66G位点(rs1801394)。方法:于2016年1月至2017年4月,在河北省儿童医院检验科收集200例健康体检儿童的抗凝全血标本。利用T-ARMS-PCR原理及多重嵌合引物策略设计rs1801133,rs1801131,rs1805087和rs1801394位点的特异性内外嵌合引物。通过优化引物浓度和反应条件,经单管PCR反应后结合QIAxcel毛细管电泳分析扩增产物长度,判读标本以上四个SNP位点的基因型,并与直接测序法所得结果进行比较。结果:本研究所建立的多重T-ARMS-PCR结合毛细管电泳分析的方法可在3小时内一次性识别叶酸代谢通路相关的四个SNP位点的8个不同等位基因,可对200例全血标本的SNP位点准确分型,其分型结果与测序法完全相符。结论:本研究所建立的多重T-ARMS-PCR方法,可简单、快速、准确地实现单管一次性检测叶酸代谢通路相关的四个SNP位点。第二部分四个叶酸代谢通路相关SNP位点与先天性心脏病相关性的研究目的:探究5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)C677T位点,A1298C位点,以及蛋氨酸合成酶(MS)A2756G位点和蛋氨酸合成酶还原酶(MTRR)A66G位点多态性与先天性心脏病(CHD)之间的关系。方法:采用病例-对照研究,限制相应条件于2016年1月至2017年4月在河北省儿童医院心脏外科收集了200名CHD患儿作为病例组,200名健康体检儿童作为对照组。采用多重T-ARMS-PCR方法检测两组儿童的MTHFR C677T和A1298C位点,MS A2756G位点,以及MTRR A66G位点的基因型及其分布,并采用SPSS21.0软件的χ~2检验来分析上述4个SNP位点与全部CHD以及单一和多发畸形型CHD发病风险之间的关系。结果:MTHFR C677T位点的等位基因T携带者相对于等位基因C携带者发生CHD的OR=2.47(95%CI:1.86~3.29,P0.001)。与纯合子CC型比较,CT型杂合子个体患CHD的OR=2.32(95%CI:1.35~3.98,P0.05),而TT型纯合突变个体患CHD的风险是CC型个体的5.37倍(95%CI:3.01~9.60,P0.001);MTHFR A1298C位点等位基因C携带者相比于等位基因A携带者发生CHD的OR=0.53(95%CI:0.36~0.77,P0.05)。杂合子AC型个体患病风险低于野生型纯合子AA个体OR=0.41(95%CI:0.26~0.64,P0.001);在分类后的单一及多发畸形型CHD中,以上两个位点的等位基因频率及基因型频率依然具有统计学意义(P0.05)。以上两位点的组合基因型分析显示:相比于携带双野生型CC/AA的个体,携带CT/AA的个体患病风险增加到了4.65倍(95%CI:2.16~10.02);TT/AA型个体增加到了7.05倍(95%CI:3.37~14.79)。统计结果表明MS A2756G和MTRR A66G位点无论是对全部CHD还是对分类后的单一及多发畸形型CHD的发生均无影响(P0.05)。结论:MTHFR C677T位点的突变型等位基因T可能是CHD的危险因素,A1298C位点的突变型等位基因C可能为CHD的保护因素,这两个位点对CHD的发生可能存在联合作用。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R446.11;R541.1
【部分图文】：

原理图,原理图

-ARMS-PCR原理图

分型,位点,样本,情况

研究论文15图2 直接测序法判读样本四个SNP位点分型情况Fig.2 Genotyping of the four SNPs by direct sequencing

图 3 单一位点引物特异性验证Fig.3 The verification of primers' specificity of each single SNP

【参考文献】