β3-肾上腺素能受体在LPS致脓毒性休克大鼠心肌抑制中的变化及作用的研究

发布时间：2020-10-22 04:31

　　 前言脓毒症(sepsis)是由感染所致的全身炎症反应综合征,重症脓毒症及脓毒性休克的年发病率在逐步上升,病死率接近50%。脓毒症心肌抑制的特征为收缩功能损害,心脏扩大、射血分数下降、对容量负荷收缩反应差、收缩峰值压力/收缩末期容积比值下降等,心肌抑制造成的心功能不全或衰竭在重症脓毒症非常常见,心功能衰竭程度与疾病严重度及病死率密切相关。然而,脓毒症心肌抑制的病理生理机制并不十分明了,与严重心肌缺血缺氧或严重心肌病变导致的心功能障碍不同,脓毒性心肌功能障碍通常没有严重心肌坏死,推测脓毒性心功能障碍以功能性、一过性改变为主,而明确脓毒症一过性心肌抑制的病理生理机制有助于临床医生找到新的治疗靶点,降低危重病人的病死率。β-肾上腺素能受体(β-AR)是调节心脏功能的重要物质,重症脓毒症及脓毒性休克时心肌抑制的发生发展与β-AR信号转导系统变化密切相关。正常情况下,心脏β1-AR的表达量约为70%~80%,β2-AR为20%~30%,β3-AR相对较少,而在病理状态下(如衰竭心脏),三种受体密度有明显改变,研究发现心肌缺血和扩张心肌病患者的心室肌中β3-AR的蛋白表达量出现了上升现象,在其他病理状态下心脏β3-AR也出现了高表达。β3-AR激活需要比β1-AR和β2-AR激活浓度更高的儿茶酚胺量,病理状态下可能是由于组织或循环中的高儿茶酚胺水平激活了β3-AR,使其水平上调,重症脓毒症及脓毒性休克病人血清中儿茶酚胺浓度明显增高,这其中除了病人自身产生的内源性儿茶酚胺外,作为治疗干预,外源性儿茶酚胺的输入可以使肾上腺素或去甲肾上腺素成倍的升高。然而β3-AR的增加在脓毒症心肌抑制中到底扮演了何种角色,是对儿茶酚胺浓度过高的代偿性保护反应还是脓毒症心肌抑制的促进因子目前尚不清楚。无论在心肌细胞水平还是大体心脏水平,许多研究都已证明激动β3-AR会产生负性肌力作用,此作用通过激活抑制性G蛋白(Gi蛋白),继而增加一氧化氮(NO)释放而实现,NOS/NO-cGMP-PKG可能是β3-AR的下游信号转导通路,且与其抑制L型钙通道及细胞内钙瞬变的幅度有关。现已证实心脏中有三种NOS亚型,内皮型NOS(eNOS,NOS3),神经元型NOS(nNOS,NOS1)和诱导型NOS(iNOS,NOS2)。NOS3和NOS1在心脏功能性地表达,而NOS2在病理状态下才有表达。研究显示三种NOS亚型均在β3-AR介导的心脏疾病中发挥了作用,但究竟哪一种亚型的NOS在脓毒症心肌抑制中发挥主要作用,且其与β3-AR的关系尚不明确。本研究以LPS致脓毒性休克大鼠(大体、单个细胞)及LPS诱导的原代培养的心肌细胞为对象,观察心肌抑制产生的情况,并以心肌抑制发生为时间点,大体水平动态检测β1、2、3-AR及各亚型NOS的变化(蛋白、mRNA水平),根据大体结果检测原代细胞水平β3-AR及主亚型NOS的变化(蛋白、mRNA水平),并在原代细胞水平通过β3-AR激动剂及NOS抑制剂初步探讨β3-AR在LPS致心肌抑制的作用机制,为β3-AR及其相关通路在脓毒性休克中的作用及机制打下基础。实验材料及方法一、动物模型制备及分组1.大鼠脓毒性休克模型建立本实验采用内毒素静脉给药的方法建立大鼠脓毒症模型。20%乌拉坦溶液5ml/kg腹腔注射麻醉大鼠,剪开左侧腹股沟皮肤,逐层钝性分离组织及肌肉,暴露左侧股动脉并置管,通过三通头与Biopac多导电生理记录仪压力换能器连接(预先排净管路内所有气泡),用于连续监测平均动脉压(MAP);同法右侧暴露股静脉,用于经股静脉给药,待大鼠左心室插管成功稳定15min后泵入LPS 15mg/kg(溶于3ml/kg液体),泵速为0.1ml/min,当MAP较基础值降低25-30%时视为脓毒性休克。2.实验动物分组⑴确定脓毒性休克时间点实验分组:按随机数字表法把Wistar大鼠分为LPS组和对照组,每组10只动物,对照组给予股静脉泵入生理盐水3ml/kg,泵速同前。两组大鼠均在体连续监测心功能6h。⑵用于标本收集实验:按随机数字表法把Wistar大鼠分为6组,每组10只动物。依据实验⑴结果分析,实验组按照给予LPS后不同时间点分为2h、4h、6h组,对照组按实验组各时间点设立对照,给予股静脉泵入生理盐水3ml/kg,泵速同前。二、动物标本采集和处理实验⑵:每组大鼠给予处理至相应时间点后经腹主动脉采血(3-4ml),之后迅速剪开胸腔,剪取心脏置于4℃的生理盐水中,以便于心脏内的残余血泵出,留取左心室肌,-80℃冰箱保存,用于Real-timePCR及Western Blot检测。采集的动脉血放置15min后离心,3000r/min离心10min,取上清装入EP管,-80℃冰箱保存,用于ELISA检测。三、大鼠心肌细胞急性分离选择LPS 4h大鼠为实验组,对照组为相同时间点给予生理盐水的大鼠,每组8只,给药方式同前。采用Langendorff装置进行主动脉逆行灌注,消化液恒压灌流的方法分离单个心肌细胞。四、新生大鼠心肌细胞原代培养选取生后1天的Wistar大鼠,无菌条件下取左心室肌,采用磁力搅拌器、胰酶和胶原酶混合多次消化的方法分离心肌细胞,并进行原代培养,给予LPS孵育后进行钙瞬变测量和分子生物学检测。五、实验方法及检测指标1.活体大鼠左心室插管术及心功能测定。2.ELISA方法检测大鼠血清肌钙蛋白I(cTn I)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)。3.Real-timePCR检测心肌组织β1、2、3-AR及各亚型NOS mRNA表达。4.Western Blot检测心肌组织β1、2、3-AR及各亚型NOS蛋白表达。5.单个心肌细胞收缩/舒张功能及钙瞬变的测定。6.原代培养心肌细胞多细胞钙瞬变测定。7.Real-timePCR检测心肌细胞β1、2、3-AR及NOS2 mRNA表达。8.Western Blot检测心肌细胞β3-AR及NOS2蛋白表达。9.不同药物组多细胞钙瞬变的自身对照研究。六、统计学分析一正态分布数据以均数±标准差(X±SD)表示,两组间比较用t检验,独立样本多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),连续监测数据采用重复测量的方差分析,采用spss13.0统计软件进行数据分析,P﹤0.05为有显著性差异。结果1.脓毒休克大鼠MAP及在体左心功能变化大鼠给予静脉泵入LPS后约1.5h开始出现血压下降,至泵入后2h血压可较基础值下降25—30%,达到休克模型。动态监测MAP变化,模型组的变化与对照组相比整体趋势有统计学差异(P﹤0.05),模型组2h、4h、6h的MAP值较其0h的基础值相比,均有统计学意义(P﹤0.05),而对照组MAP随时间变化无统计学意义,说明此方法制作的脓毒性休克模型给药后2h成模,且模型稳定。动态监测收缩期左室内压上升的最大速率(+dp/dtmax)变化,模型组的变化与对照组相比整体趋势有统计学差异(P﹤0.05),模型组2h、4h、6h值较其0h的基础值相比,均有统计学意义(P﹤0.05),而对照组+dp/dtmax随时间变化无统计学意义。舒张期左室内压下降的最大速率(-dp/dtmax)模型组的变化与对照组相比整体趋势有统计学差异(P﹤0.05),模型组4h、6h值较其0h的基础值相比,均有统计学意义(P﹤0.05),而对照组-dp/dtmax随时间变化无统计学意义。2.脓毒休克大鼠血清cTnI及CK-MB变化动态监测脓毒性休克大鼠血清cTnI及CK-MB变化,各时间点与对照组比较均未发现统计学意义(P﹥0.05)。说明此种方法诱导的脓毒性休克大鼠在6h内未有明确心肌组织坏死或损伤。3.脓毒休克大鼠心肌组织β1、2、3-AR蛋白及mRNA表达脓毒性休克大鼠心肌组织β3-AR的蛋白水平在休克早期(模型2h)是升高的趋势,较同时间点对照组相比有统计学意义(P﹤0.05),之后呈下降趋势,至休克晚期(模型6h)较对照组相比有统计学意义(P﹤0.05)。心肌组织β3-AR mRNA水平与蛋白水平变化一致。β1、2-AR的蛋白水平和mRNA水平与同时间点对照组比较无统计学意义。4.脓毒休克大鼠心肌组织各型NOS蛋白及mRNA表达脓毒性休克大鼠心肌组织NOS2蛋白水平在休克早期与对照组比较无统计学意义,在LPS处理后4h、6h出现升高趋势,且与同时间点对照组比较有统计学意义(P﹤0.05),而心肌组织NOS2 mRNA水平在各个时间点均高于对照组(P﹤0.05)。NOS1及NOS3蛋白水平在各个时间点与对照组相比变化无统计学意义,NOS1 mRNA水平在LPS处理2h时较对照组明显升高(P﹤0.01),NOS3mRNA水平在各个时间点均低于对照组(P﹤0.05),但此两种亚型的NOS与蛋白水平变化不一致,说明在此模型中此两种亚型可能不起到主要作用。5.脓毒休克大鼠单个心肌细胞收缩/舒张功能经LPS处理4h的大鼠单个心肌细胞较对照组相比,在收缩幅度(peak shorting,PS)、收缩/舒张最大速率积分(+d L/dt、-dL/dt)方面明显下降(P﹤0.01);在达到峰值90%的时程(time to 90%PS,TPS_(90))及舒张到90%的时程(time to 90%relengthening,TR_(90))方面明显延长(P﹤0.01)。6.脓毒休克大鼠单个心肌细胞钙瞬变经LPS处理4h的大鼠单个心肌细胞较对照组相比,在静息钙浓度(baseline FFI)、收缩时钙浓度峰值(peak FFI)及钙瞬变幅度(deta FFI)方面明细下降(P﹤0.05);在钙浓度恢复至基线水平90%的时间(TR_(90))及钙衰减时间常数(tau)方面明显延长(P﹤0.01)。7.LPS诱导的原代培养心肌细胞钙瞬变原代培养的新生大鼠心肌细胞经终浓度为1μg/ml的LPS作用8、16、24h,24h组细胞较给予LPS前自发搏动明显减少,细胞状态差,故未参与钙瞬变的测定。与正常对照组比较,LPS16h组钙瞬变发生了明显变化,表现为钙瞬变幅度(detaF/F0)降低、钙浓度恢复50%的时程(TR_(50))延长及钙浓度衰减时间常数(tau)增加(P﹤0.05),而LPS 8h组变化较正常组没有统计学意义。8.LPS诱导16小时原代培养心肌细胞β3-AR蛋白及β1、2、3-AR mRNA变化原代培养的心肌细胞经LPS孵育16小时后β3-AR蛋白及mRNA水平均较空白对照组升高(P﹤0.05),而β1、2-AR mRNA水平均较空白对照组变化无统计学意义。9.LPS诱导16小时原代培养心肌细胞NOS2蛋白及mRNA变化原代培养的心肌细胞经LPS孵育16小时后NOS2蛋白及mRNA水平均较空白对照组升高(P﹤0.05)。10.不同药物组多细胞钙瞬变的自身对照结果原代培养的心肌细胞经LPS孵育16h后,在给予β1、2-AR特异性抑制剂同时激动β3-AR整体钙瞬变下降,与normal组比较有统计学意义(P﹤0.05),提前给予NOS抑制剂后此作用消失。结论1.LPS诱导的脓毒性休克大鼠模型稳定,心功能随时间点延长而呈持续下降趋势,未出现明显心肌损伤。β3-AR在整个脓毒性休克过程中可能起到保护作用。NOS2在整个脓毒性休克过程中相对其他两种亚型发挥了主要作用,其与β3-AR的关系需进一步研究。2.脓毒休克大鼠心肌细胞在除外神经体液因素的基础上仍然存在心肌收缩/舒张功能障碍及钙稳态失衡。3.原代培养的新生大鼠心肌细胞在终浓度为1μg/ml的LPS诱导16h后出现整体钙瞬变的降低,激动β3-AR后细胞自身的钙瞬变随时间延长下降,且通过NOS途径发挥此作用。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R459.7
【部分图文】：

成簇生长×100图 3.1，心肌细胞图片3.心肌细胞的鉴定⑴倒置相差显微镜观察细胞形态⑵心肌细胞 α-横纹肌肌动蛋白抗甲醛固定室温 30min，PBS 洗 3 次，5minPBS 洗涤 3 次，5min/次；5%BSA 封闭度（1：200）的抗体(小鼠抗大鼠 α-Sar静置 10min，PBS 洗 3 次，5min/次；加入抗体），避光室温染色 4h，用 PBS 洗 3工作浓度 0.5-10ug/ml），每孔 150ul，室温甘油封闭后照相、计数（图 2），经统计

心肌细胞鉴定图（×400）细胞经钙荧光指示剂负载后，倒置荧光显微镜下可看到心刺激后可看到心肌细胞跟随电刺激频率的一致性跳动。.3，经钙荧光指示剂负载后的心肌细胞静态图（×10）立及标本收集

323，经钙荧光指示剂负载后的心肌细胞静态图（×10）立及标本收集养心肌细胞钙瞬变测定模型：取 6 孔板爬片培养的 72 小常对照组；LPS 组细胞给予 LPS 终浓度为 1μg/ml（文献浓16、24 小时，正常对照组给予空白培养基 2ml 孵育相同养心肌细胞标本收集：取 LPS 作用 16 小时及相应时间瓶生长，5ml 培养基），采用酶消化法收集细胞标本。具，PBS 洗一遍，加入 1ml 含胰酶 0.25%的 PBS，放入培养见原来贴壁细胞悬浮于液体中，轻轻晃动培养瓶使大部分培养基中和，轻柔吹打，收集液体至离心管中，1000r，胞沉淀放入含 10%DMSO 培养基中，冻存管-80℃
【参考文献】

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1 杨乐;邹晓静;李树生;万磊;姚尚龙;杨光田;;脓毒症心肌抑制研究进展[J];内科急危重症杂志;2010年01期

2 贾月霞;潘舂水;杨靖辉;耿彬;张靓;赵晶;唐朝枢;齐永芬;;败血症休克大鼠血管外膜L-精氨酸/一氧化氮合酶/一氧化氮通路的变化[J];中国病理生理杂志;2007年03期

本文编号：2851094