基于细胞SELEX技术的MMP14特异性适配体筛选及双模态分子探针的构建与初步功能研究

发布时间：2020-10-26 10:56

　　 目的:1.构建特异性高表达MMP14蛋白的转染细胞系,并利用该细胞系通过细胞SELEX技术筛选特异性识别MMP14蛋白的适配体;2.利用筛选的特异性适配体构建磁共振和荧光的双功能分子探针并检测其成像效果。方法:1.通过基因合成方法构建MMP14基因的慢病毒载体,并通过该载体转染293T细胞构建特异性高表达MMP14蛋白的293T-MMP14细胞。2.通过化学合成的方法构建一个ssDNA文库,其中心为40个碱基的随机序列,前后均为固定的引物序列。通过细胞SELEX技术,以转染后的293T-MMP14细胞为正筛细胞,以MMP14蛋白阴性表达的293T-Plasmid细胞为负筛细胞筛选MMP14蛋白特异性适配体,经过12轮筛选后对筛选文库进行PCR扩增、质粒转染、单克隆挑选及测序获得适配体候选对象,通过流式细胞术验证候选对象与293T-MMP14细胞的亲和力;选择亲和力最高的适配体,通过流式细胞术测试Kd值用以评估其结合特异性;通过细胞免疫荧光与流式细胞术测试适配体与胰腺癌细胞系的结合能力。3.以筛选的适配体为亲和组件,通过化学合成的方法在其5’端标记Cy5,3’端标记氨基,再与磷脂-羧基聚乙二醇修饰的磁性Fe_3O_4纳米颗粒(末端标记羧基)PEG@Fe_3O_4通过氨基羧基的缩合反应连接,构建标记荧光素Cy5与磁共振对比剂Fe_3O_4的双模态分子探针。通过细胞免疫荧光及荷瘤裸鼠模型检测其荧光成像功能,通过磁共振扫描检测其在细胞层面的磁共振对比成像功能。结果:1.MMP14基因慢病毒载体成功转染293T细胞,建立特异性高表达MMP14蛋白的293T-MMP14细胞。2.经过12轮筛选共获得24个有效适配体序列,通过流式细胞术检测发现M17适配体与293T-MMP14细胞亲和力最高,其Kd值为4.98±1.26nM,处于nmol级别;通过细胞免疫荧光发现其可特异性结合在293T-MMP14细胞膜表面;流式细胞术检测发现M17可特异性结合胰腺癌细胞系MIA PaCa-2与PANC-1。3.以PEG修饰的磁性纳米颗粒(末端标记羧基)PEG@Fe_3O_4为核心,通过氨基羧基缩合反应将5’端标记Cy5,3’端标记氨基的Cy5-M17-氨基适配体偶联至PEG@Fe_3O_4外表面构建成PEG@Fe_3O_4-M17-Cy5的双模态分子探针。细胞免疫荧光及磁共振扫描验证该探针可以特异性的对胰腺癌细胞系MIA PaCa-2与PANC-1进行荧光显像并能明显降低细胞的T2WI信号;通过对荷瘤裸鼠的荧光成像发现该探针可以在活体水平实现对PANC-1细胞裸鼠皮下移植瘤的靶向性荧光成像。结论:1.通过细胞SELEX技术筛选的适配体可以特异性识别MMP14蛋白高表达的细胞系,并能特异性结合胰腺癌MIA PaCa-2与PANC-1细胞系。该适配体有望作为一种亲和组件构建分子探针,实现对MMP14蛋白高表达的肿瘤的早期诊断及靶向治疗。2.以M17为亲和组件构建的PEG@Fe_3O_4-M17-Cy5的双模态分子探针可以实现对胰腺癌MIA PaCa-2与PANC-1细胞的荧光染色,并能有效降低两种细胞的T2WI信号强度,实现对裸鼠MIA PaCa-2细胞皮下移植瘤的靶向荧光成像。该探针在胰腺癌及其他MMP14蛋白高表达肿瘤的靶向诊断上有一定的应用潜力。
【学位单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R445.2;R735.9
【部分图文】：

空军军医大学博士学位论文进行扩增，得到标记 FITC 的次级文库，通过流式细胞术检测文库的富集程）克隆测序：通过流式细胞术监测到文库中特异性识核酸序列足够丰富时选，通过克隆测序获得候选适配体，然后对这些候选对象进行化学合成合力和特异性的鉴定。细胞 SELEX 筛选的时间一般在三个月左右。EX 筛选示意图[137]如下：

空军军医大学博士学位论文序列中酶切位点，起始密码子、终止密码子位置是否合理；上序列送奥科鼎盛生物科技有限公司进行基因合成。载体的准备选择实验室保存的 pCDH-CMV-MCS–EF1-Puro(CD510B-1)，酶切位点包括 5’-XbaⅠ-NheⅠ-EcoRⅠ-BstBⅠ-SwaⅠ-BamHⅠ 5’-XbaⅠ-NheⅠ- BamHⅠ-AgeⅠ-EcoRⅠ-EcoR Ⅴ-XhoⅠ-S’。选用的酶切位点为 NheⅠ和 EcoRⅠ。pCDH-CMV-MCS–EF1下：

08段部分测序结果
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本文编号：2856904