齐墩果酸放射增敏治疗中肿瘤生物学改变及分子影像学评价

发布时间：2020-10-26 15:50

　　 目的:研究从中草药中提取的天然药物齐墩果酸对大鼠C6肿瘤的放射增敏作用及机制;采用正电子乏氧显像~(18)F-氟硝基咪唑正电子发射断层显像-X线计算机断层成像(~(18)F-Fluoromisonidazol Positron Emission Tomography/Computed Tomography,~(18)F-FMISO PET/CT)监测肿瘤乏氧改变及齐墩果酸的放射增敏疗效;病理检测放射增敏治疗后肿瘤组织生物学改变,旨在探讨齐墩果酸增敏机制及正电子乏氧显像~(18)F-FMISO PET/CT对肿瘤乏氧诊断及放射增敏剂疗效评价的价值。方法:1.体外实验研究齐墩果酸对大鼠C6肿瘤细胞的放射增敏作用及机制,方法包括MTT实验、集落形成实验、Real-time PCR和Western blot实验。MTT实验:采用氯化钴(CoCl_2)化学乏氧法模拟肿瘤乏氧微环境,将C6肿瘤细胞分为常氧和乏氧组,给予梯度浓度齐墩果酸药物孵育12 h、24 h、48 h,酶联免疫检测仪测定细胞吸光度,计算抑制率绘制存活曲线,软件分析获取齐墩果酸作用于C6肿瘤细胞24 h的半数致死剂量(Half effective inhibition concentration,IC_(50));集落形成实验:齐墩果酸对大鼠C6肿瘤细胞放射敏感性的影响采用集落形成实验观察。将20%IC_(50)及30%IC_(50)的齐墩果酸预处理常氧和乏氧C6细胞24 h后给予0~8 Gy梯度剂量照射,2周后观察各组肿瘤细胞的集落形成率。分析计算氧增比(Oxygen enhancement ratio,OER)、齐墩果酸对肿瘤细胞放射增敏比(Sensitive enhancement ratio,SER)。Real-time PCR和Western blot实验:20%IC_(50)及30%IC_(50)浓度齐墩果酸放射增敏治疗对乏氧C6肿瘤细胞乏氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)mRNA和蛋白表达的影响分别采用Real-time PCR和Western blot法测定。2.动物实验研究齐墩果酸对大鼠C6肿瘤模型的放射增敏作用,以抑瘤率及荷瘤鼠生存期为疗效评估标准。构建大鼠下肢皮下C6肿瘤模型,按照随机数字表法分为对照组、齐墩果酸组、放疗组及齐墩果酸联合放疗组,每组各6只。每周测量肿瘤大小,计算肿瘤体积,绘制肿瘤体积增长曲线,以治疗后各组肿瘤体积均值计算抑瘤率;记录各组荷瘤鼠死亡时间进行生存分析。3.~(18)F-FMISO PET/CT显像将构建好的大鼠C6肿瘤模型按照随机数字表法分为对照组、齐墩果酸组、放疗组及齐墩果酸联合放疗组,每组各6只,用于治疗前及治疗后24 h的肿瘤乏氧显像研究。PET/CT图像分析方法采用视觉分析法结合半定量分析法,选取肿瘤放射性浓聚最浓层面,勾画感兴趣区,得到肿瘤最大标准摄取值(Maximal standard uptake value of tumor,SUVmax-tumor)及同层面对侧下肢正常肌肉组织最大标准摄取值SUVmax-muscle,计算肿瘤与肌肉摄取比值(Tumor muscle ratio,TMR)作为疗效评估指标。4.病理学实验显像完成后,取荷瘤鼠肿瘤组织进行病理学实验,包括肿瘤大体观察、HE染色、免疫组织化学染色。免疫组织化学染色测定指标包括:HIF-1α、Glut-1、Ki67、P53及MVD。5.统计学分析统计软件SPSS17.0分析上述体外实验、动物实验、~(18)F-FMISO PET/CT显像、病理学实验结果,探讨齐墩果酸对C6肿瘤的放射增敏作用及机制;对~(18)F-FMISO PET/CT显像半定量参数TMR与肿瘤生物学指标进行相关性分析及回归分析,探讨~(18)F-FMISO PET/CT对肿瘤乏氧诊断及放射增敏剂对肿瘤生物学影响的可视化评估价值。结果:1.体外实验齐墩果酸药物对常氧和乏氧的C6肿瘤细胞均有抑制作用,药物浓度越高、作用时间越长,抑制作用越强,细胞存活率越低;齐墩果酸对常氧C6细胞的抑制作用强于乏氧C6细胞;齐墩果酸作用于常氧和乏氧C6细胞24 h的半数致死量IC_(50)值分别为42μg/mL和68μg/mL。集落形成实验发现,梯度剂量的X线照射下,乏氧C6细胞表现出放射抵抗,存活率高于同剂量照射下常氧C6细胞,计算氧增比OER为1.15;20%IC_(50)及30%IC_(50)浓度的齐墩果酸对常氧和乏氧C6细胞均有放射增敏作用,20%IC_(50)齐墩果酸对常氧和乏氧C6细胞放射增敏比SER分别为1.51、1.64;30%IC_(50)齐墩果酸对常氧和乏氧C6细胞放射增敏比分别为1.72、1.87。Real-time PCR和Western blot结果示20%IC_(50)、30%IC_(50)的齐墩果酸联合照射组乏氧C6肿瘤细胞的HIF-1αmRNA水平显著低于单纯照射组(t=3.35,5.58,P均0.05),HIF-1α蛋白水平亦显著低于单纯照射组(t=7.98,13.62,P均0.01);齐墩果酸药物组与对照组对比,30%IC_(50)药物浓度的齐墩果酸能有效下调乏氧C6肿瘤细胞HIF-1αmRNA水平,差异有统计学意义(t=3.21,P0.05),但HIF-1α蛋白表达水平与对照组差异无统计学意义。2.动物实验治疗前及治疗后24 h,对照组荷瘤鼠肿瘤体积分别为(0.62±0.05,1.65±0.09)cm~3,齐墩果酸组荷瘤鼠肿瘤体积分别为(0.65±0.04,1.69±0.11)cm~3,放疗组荷瘤鼠肿瘤体积分别为(0.62±0.04,0.78±0.19)cm~3,齐墩果酸联合放疗组荷瘤鼠肿瘤体积分别为(0.63±0.08,0.81±0.26)cm~3;齐墩果酸组与对照组肿瘤体积差异无统计学意义;放疗组及齐墩果酸联合放疗组较对照组表现出明显抑瘤作用,以体积均值计算抑瘤率分别为52.73%、51.91%;齐墩果酸联合放疗组较单纯放疗组肿瘤体积差异无明显统计学意义。对照组荷瘤鼠生存期为43.67±3.3(33~52)天,齐墩果酸组荷瘤鼠生存期为44.62±3.1(35~54)天,放疗组荷瘤鼠生存期为53.3±2.2(43~61)天,齐墩果酸联合放疗组荷瘤鼠生存期为56.8±2.6(44~65)天;接种肿瘤第60天时各组荷瘤鼠存活率分别为0、0、16.7%及33.3%。Kaplan-Meier生存分析法检验各组荷瘤鼠生存期差异有统计学意义(χ~2=12.15,P0.01)。3.~(18)F-FMISO PET/CT显像治疗前,统计所有荷瘤鼠肿瘤TMR水平为(1.29±0.12),以TMR1.2为乏氧标准,乏氧肿瘤占肿瘤总数的比例为91.7%(22/24);治疗后24 h,对照组乏氧肿瘤比率100%(6/6),齐墩果酸组乏氧肿瘤比率100%(6/6),放疗组乏氧肿瘤比率66.7%(4/6),齐墩果酸联合放疗组乏氧肿瘤比率33.3%(2/6)。各组荷瘤鼠肿瘤TMR治疗前后对比,结果显示对照组荷瘤鼠肿瘤TMR值为(1.28±0.08,2.78±0.16;t=22.89,P0.01),以均值计算肿瘤TMR增长率为117.18%;齐墩果酸组荷瘤鼠肿瘤TMR值为(1.29±0.16,2.61±0.22;t=17.7,P0.01),以均值计算肿瘤TMR增长率为102.32%;放疗组荷瘤鼠肿瘤TMR值为(1.28±0.06,1.24±0.32;t=1.09,P0.05),以均值计算肿瘤TMR降低率为3.12%;齐墩果酸联合放疗组荷瘤鼠肿瘤TMR值为(1.30±0.07,1.15±0.13;t=3.26,P0.05),以均值计算肿瘤TMR降低率为11.54%。4.病理学实验大体观察,瘤体包膜完整,与周围组织有分界,切开后肿瘤边缘组织呈淡红色鱼肉样,中央区域呈灰白色肉糜样;HE染色见异型性明显的肿瘤细胞核大深染,排列密集紊乱,坏死区域呈颗粒、条块状红染;放疗组及齐墩果酸联合放疗组肿瘤细胞出现核固缩、核溶解、核破裂等细胞不可逆损伤征象。免疫组化结果示对照组、齐墩果酸组、放疗组及齐墩果酸联合放疗组肿瘤组织HIF-1α阳性细胞百分率分别为(84.53±4.91,81.82±6.45,52.53±6.87,38.87±6.32)%,Glut-1阳性细胞百分率分别为(89.24±5.88,89.87±3.94,67.25±9.76,45.09±9.61)%,Ki67阳性细胞百分率分别为(35.57±4.39,36.52±4.62,19.53±6.78,15.85±4.83)%,P53阳性细胞百分率分别为(53.06±10.41,52.84±11.93,27.79±12.45,30.38±13.02)%,MVD分别为(19.01±5.34,18.37±4.98,9.06±3.35,9.67±3.68);单因素方差分析各生物学指标的组间对比,差异均有统计学意义(F=78.83,45.94,25.43,7.98,9.25,P均0.01);LSD法两两组间对比结果示齐墩果酸药物组与对照组肿瘤各生物学指标表达差异均无统计学意义,齐墩果酸联合放疗组与放疗组肿瘤各生物学指标表达对比,其中齐墩果酸联合放疗组肿瘤HIF-1α和Glut-1阳性细胞百分率低于放疗组(P0.01,P0.05),而Ki67、P53及MVD水平两组间无统计学差异。5.统计学分析对~(18)F-FMISO PET/CT显像半定量参数TMR与肿瘤生物学指标进行相关性分析结果示TMR与HIF-1α(%)、Glut-1(%)、Ki67(%)、P53(%)、MVD呈不同程度正相关关系,相关系数r分别为0.92、0.86、0.89、0.70、0.81,P均0.01;多元线性回归分析法以TMR为因变量,HIF-1α、Glut-1、Ki67、P53、MVD表达结果为自变量,结果显示肿瘤组织HIF-1α阳性细胞百分率是TMR值的独立影响因素(P0.01)。结论:天然药物齐墩果酸对C6肿瘤有放射增敏作用,其主要机制与下调乏氧C6肿瘤细胞HIF-1αmRNA和蛋白表达有关;齐墩果酸协同放射治疗能有效抑制肿瘤体积增长并延长荷瘤鼠生存期;~(18)F-FMISO PET/CT显像半定量指标TMR能有效监测肿瘤乏氧状态及齐墩果酸早期增敏疗效;齐墩果酸联合放疗能显著下调肿瘤组织HIF-1α、Glut-1、Ki67、P53蛋白表达及微血管密度MVD;~(18)F-FMISO摄取程度指标TMR与肿瘤组织HIF-1α、Glut-1、Ki67、P53、MVD表达呈不同程度正相关关系,其中HIF-1α阳性率是TMR值的独立影响因素。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R730.55
【部分图文】：

安徽医科大学博士学位论文3. 实验结果3.1 齐墩果酸对鼠胶质瘤 C6 细胞增殖的影响取对数生长期的 C6 肿瘤细胞，加入 150 μg/mL、75 μg/mL、37.5 μg/mL、18.75μg/mL、9.37 μg/mL 梯度浓度 OA 分别孵育 12 h、24 h 及 48 h 后 MTT 法测定细胞存活率。结果发现药物浓度越高、作用时间越长，抑制作用越强，细胞存活率越低（见图 1）。以孵育 24 h 为时间节点计算 OA 对常氧及乏氧 C6 细胞的半数致死量 IC50值分别为 42 μg/mL 和 68 μg/mL。

图 2. C6 细胞存活曲线图（A：常氧 C6 细胞；B: 乏氧 C6 细胞）Figure 2. Survival fractions of C6 glioma cells in different treatment groups measuredby the colony-forming assay（A: normoxic C6 cells; B: hypoxic C6 cells）表 1. OA 对 C6 细胞的放射增敏作用参数Table 1. Radiosensitizing effect of OAon normoxic and hypoxic C6 glioma cellsD0Dq SER OERNormoxic C6 cellsIR 3.72 0.87IR + 20% IC50OA 2.46 0.65 1.51IR + 30% IC50OA 2.16 0.51 1.72IR 4.27 1.28 1.15

安徽医科大学博士学位论文3.3 OA 联合照射对乏氧肿瘤细胞 HIF-1α mRNA 和蛋白表达的影响乏氧 C6 细胞 HIF-1α mRNA 和蛋白表达通过 Real time-PCR 和 Western blot测定（见图 3）。20% IC50、30% IC50的 OA 预处理乏氧 C6 细胞 24 h 联合 2 Gy照射组肿瘤 HIF-1α mRNA 显著低于单纯照射组（t = 3.35, 5.58, P 均 < 0.05）；20%IC50、30% IC50联合 2 Gy 照射组 C6 细胞 HIF-1α蛋白表达显著低于单纯照射组 (t= 7.98, 13.62, P 均< 0. 01)。20% IC50、30% IC50的 OA 药物组与对照组对比，30%IC50浓度 OA 有效下调乏氧 C6 细胞 HIF-1α mRNA 水平，差异有统计学意义（t=3.21, P < 0.05），但 HIF-1α 蛋白表达水平与对照组差异无统计学意义。
【参考文献】

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本文编号：2857194