叶酸竞争抑制ELISA检测方法的建立

发布时间：2020-11-01 21:49

　　 叶酸属B族维生素一员,是细胞分裂和维持细胞活性的重要组分,具有辅助转运一碳单位的功能。叶酸缺乏是诱发巨幼红细胞贫血、神经管畸形、先天性心脏缺陷和某些心血管疾病的重要危险因素。因此建立快速、便捷、准确的叶酸水平检测方法,对于提高全民健康水平、开展优生优育以及叶酸强化产品的市场监管,均有着重要的意义。本课题通过碳二亚胺法,将叶酸和牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白分别偶联合成了叶酸免疫原(FA-BSA、FA-BSA-ACA)和包被原(FA-OVA),蛋白浓度分别为12.59 mg/mL、10.8 mg/mL、9.71mg/mL。经紫外扫描进行了效果鉴定,并利用OPA法测得偶联比分别为13.16:1、8.90:1和4.22:1。使用FA-BSA与佐剂乳化后皮下注射的方法免疫小鼠,四次免疫后测定效价为1:60000,间接竞争试验的IC50为0.695μg/mL;抗体效价和性能均优于FA-BSA-ACA的免疫结果。因此取FA-BSA免疫后的小鼠脾细胞与培养的SP2/0细胞进行融合试验,融合后7天获得了能够生长的杂交瘤细胞,两周后进行ELISA试验检测上清,共有60孔阳性。将阳性孔内细胞进行有限稀释,最终检测上清无明显变化,考虑可能为杂交瘤细胞分泌抗体功能丢失。利用FA-BSA免疫家兔制备多克隆抗体,家兔血清效价为1:128000,间接竞争试验的IC50为59.91μg/mL。采用亲和层析纯化兔血清中抗叶酸的多克隆抗体,经BCA法定量蛋白浓度为0.63mg/mL,并在此基础上使用棋盘法确认最适抗原抗体工作条件,包被浓度为2 μg/mL,多抗浓度为1.27μg/mL,二抗最适稀释度为1:2000。在纯化抗体的基础上建立叶酸间接ELISA检测方法并制作标准曲线,其方程为Y=-0.4924X+0.3819,R2 值为 0.993,IC50 为 5.965 μg/mL。回收率在 83.333%-98.627%之间,批内变异系数在5.677%-8.553%之间,批间变异系数在5.217%-9.392%之间,对比未纯化的抗体检测效果有明显提高。
【学位单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R446.6
【部分图文】：

第１章?引言第１章引言??词是对蝶酰－Ｌ－谷氨酸的各种衍生形态的统称。天ｆｏｌａｔｅ）由Ｗｉｌｌｓ?Ｌ于１９３１年首次发现【１］，随后，［２］。叶酸又称蝶酰谷氨酸，分子量为４４１．４０，分子组成，对氨基苯甲酸和喋啶构成叶酸的活性部分蝶个羧基基团。??

ＦＶ？Ｓ＼??图２－１合成路线图??Ｆｉｇｕｒｅ２－１?Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ?ｓｃｈｅｍｅ??化??平秤取４．４ｍｇ叶酸，溶解于２．５?ｍＬ?ＰＢＳ溶液中，调节溶液ｐＨ至溶解，补足溶液体积至０．３?ｍＬ。加入１５ｍｇ?ＥＤＣ，避光于室温离心ｌＯｍｉｎ，保存上清。??配制??平秤取６．６ｍｇ?ＢＳＡ?，借助涡旋搅拌器，充分溶解于０．２?ｍＬ?ＰＢＳ溶１０?ｍｉｎ，保存上清。??疫原制备??后的ＦＡ溶液，缓慢逐滴加入ＢＳＡ溶液中，室温避光缓慢摇晃３ｈ

图２－２?ＦＡ、ＭＴＸ结构示意图??Ｆｉｇｕｒｅ２－２?ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ?ｆｏｒｍｕｌａｓ?ｏｆ?ＦＡ?ａｎｄ?ＭＴＸ??鼠和ＦＡ－ＢＳＡ－ＡＣＡ免疫小鼠的血清的操作步骤均按如２．３．１的方法制备ＭＴＸ－ＯＶＡ，使用碳酸缓冲液分别将至２００叩／１００叫，在９６孔板内每孔加１００４，４°Ｃ放置使用ＰＢＳＴ洗板，每次加入孔内后静置３ｍｉｎ，甩干。封闭液使用１％明胶溶液，每孔３００从，３７°Ｃ温育２ｈ封闭后ＰＢＳＴ洗板三次，将小鼠抗ＦＡ血清１：１０００、１：〇ＨＬ；未免疫小鼠血清１：１０００稀释，每孔１００以，ＰＢＳ溶液每孔加入１０〇ｎＬ当做空白对照，３７°Ｃ温育ｌｈＰＢＳＴ洗板三次后，每孔加入１：１００００稀释的ＨＲＰ洗板三次后，每孔加入显色液１００汕，室温下显色１５
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本文编号：2866147