研究背景国际疼痛研究协会(International Association for the Study of Pain,IASP)将疼痛定义为,“一种不愉快的感觉和情绪体验,往往伴随有实际的或潜在的组织伤害[1]”。神经病理性疼痛是临床上常见的慢性顽固性疼痛综合征,患者约占全球人口的7%-10%[2,3]。由于神经病理性疼痛的发病机制复杂且缺乏明确的分子机制,是临床治疗中的一大挑战。电压门控钠离子通道(Nav1.1-Nav1.9,Navx)包括河豚毒素敏感型(tetrodotoxin-sensitive,TTX-S)和河豚毒素耐受型(tetrodotoxin-resistant,TTX-R)钠离子通道,参与动作电位的产生和传导,与神经病理性疼痛的发生和维持有紧密的联系[4]。Nav1.3是TTX-S钠离子通道亚型,由SCN3A基因编码,位于2号染色体[5]。SCN3A在胚胎和新生儿中枢神经系统高表达,成年以后表达量很少,但当外周损伤或中枢神经损伤时,其表达量明显升高[5],神经病理性疼痛与SCN3A表达异常有关[6]。研究发现外周神经损伤时Nav1.3在背根神经节(doral root ganglion,DRG)高表达[7,8];Hains等在脊髓损伤模型(spinal cord injury,SCI)发现Nav1.3在脊髓背角神经元(spinal dorsal horn neurons,SDH)表达上调[9,10]。另有研究表明鞘内注射Nav1.3特异性反义核苷酸能够抑制Nav1.3的表达,缓解机械痛和热痛[11]。综上,Nav1.3可能在神经病理性疼痛的发生和维持中扮演重要角色。尽管Nav1.3参与神经病理性疼痛的相关机制已被报道,然而Nav1.3表达改变的具体机制仍不明确。非编码RNA(Non-coding RNA,NcRNA)调控蛋白质的表达成为一个研究热点。MicroRNAs(miRNAs)家族是一类内源性的非编码小RNA分子,通过与靶基因3’UTR的完全或不完全配对,降解靶基因mRNA或抑制其翻译蛋白,在基因表达的转录后调节中发挥重要作用[12,13]。MiRNAs广泛存在于体内,在病理状态,miRNAs表达异常,可能是一个潜在的治疗靶点[14]。近年来,随着研究的不断深入,miRNAs在神经病理性疼痛的作用受到越来越多的关注,逐渐成为镇痛治疗的一个新方向。利用生物信息学软件(Target Scan Human 7.1)预测,发现miR-30b与SCN3A高度相关。由此,我们提出假说:在正常生理状态下,mi R-30b能够抑制SCN3A由mRNA到Nav1.3蛋白的翻译,使Nav1.3保持稳态;在外周神经受到损伤时,miR-30b表达下调从而减少对SCN3A mRNA的抑制,Nav1.3表达增加,引起神经元兴奋性增强,从而诱发神经病理性疼痛。研究目的本实验利用脊神经损伤(spinal nerve ligation,SNL),建立大鼠神经病理性疼痛模型,检测疼痛状态下miR-30b和Nav1.3的表达变化;通过体外细胞实验验证miR-30b和SCN3A的靶标关系;在体内动物实验,过表达或抑制miR-30b的表达,检测Nav1.3 mRNA和蛋白水平的变化,同时检测大鼠痛阈变化,验证解说。实验探索内源性miR-30b对Nav1.3表达的调控机制,以期在分子水平上阐明神经病理性疼痛发生和维持的具体机制,为其临床治疗提供理论依据。研究方法(1)生物信息学软件预测与大鼠SCN3A基因相关的miRNAs。利用生物信息学软件Target Scan Human 7.1预测与大鼠SCN3A基因相关的miRNAs。(2)制作并鉴定SNL动物模型。将动物分为两组:sham组和SNL组。SNL组大鼠钝性分离左侧棘突至骶骨的椎旁肌肉,充分暴露L4-6椎体侧缘和L5脊神经,用3-0丝线结扎L5脊神经。sham组大鼠分离左侧L5脊神经并使其保留完整,其他操作与SNL组一致。通过50%机械缩足阈值(PWTs)和热缩足潜伏期(PWLs)的检测,观察行为学改变,鉴定模型是否成功;qRT-PCR,western-blot法检测Nav1.3 mRNA和蛋白水平的表达变化;免疫荧光,原位杂交法检测DRG神经元和脊髓Nav1.3和miR-30b的表达分布和共标情况。(3)双荧光素酶报告基因法检测miR-30b与SCN3A是否有靶标关系。构建包含SCN3A 3'UTR片段的pmirGLO双荧光素酶载体,在PC12细胞利用转染试剂lipofectamine 2000共转染不同剂量的miR-30b类似物miRNA mimic,agomir 10 pM,50 pM,100 pM(50 nmol/L)和野生型载体(0.5μg/mL),检测各组荧光素酶活性,确定两者靶标关系;分别转染野生型载体和突变型载体,同时共转染其他的miRNAs,荧光素酶活性用萤火虫和海肾的比值表示。(4)体外原代DRG细胞培养及转染探讨miR-30b与Nav1.3的调控关系。为探讨miR-30b是否调控Nav1.3的表达,一方面用TNF-α(100 ng/mL,2 ul)刺激原代DRG细胞,30 min后转染mi R-30b agomir,利用qRT-PCR,western-blot法检测miR-30b与Nav1.3的表达变化,评估miR-30b agomir对TNF-α刺激后Nav1.3表达的影响;另一方面,在正常DRG细胞转染miR-30b antagomir,检测Nav1.3 mRNA和蛋白的表达。(5)体内动物实验探讨miR-30b对SNL诱发的神经病理性疼痛的影响。SNL术后10 d鞘内注射miR-30b agomir(20μM,10μl),连续注药4 d,检测50%械缩足阈值(PWTs)和热缩足潜伏期(PWLs)的改变,观察大鼠行为学变化,评估miR-30b agomir的镇痛效果;qRT-CR,western-blot法检测给药前后DRG和脊髓中miR-30b和Nav1.3的表达变化,探讨miR-30b调控Nav1.3参与神经病理性疼痛的机制;反向地,在正常大鼠鞘内注射miR-30b antagomir(20μM,10μl)(从第1 d连续注药4 d),检测大鼠对机械刺激和热刺激的敏感性,评估miR-30b antagomir对痛行为的影响;qRT-PCR,western-blot检测Nav1.3 mRNA和蛋白水平的变化。研究结果(1)Target Scan Human 7.1预测结果表明与SCN3A相关的miRNAs包括miR-30abcde-5p/384-5p,miR-96/182/183-5p,miR-132-3p/223-3p。(2)SNL神经病理性疼痛制作成功,Nav1.3表达升高,miR-30b表达降低。与sham组相比,SNL术后3 d术侧机械痛阈和热痛阈明显降低,持续到21d(***P0.0001),模型制作成功;qRT-PCR和western-blot数据表明,在SNL大鼠DRG神经元中Nav1.3 mRNA和蛋白表达增加,miR-30b表达减少,脊髓中有类似的现象;荧光双标结果表明在DRG神经元中Nav1.3主要表达于无髓鞘的伤害性感觉神经元(IB4和CGRP),与有髓鞘的非伤害性神经元标记物NF200及胶质细胞标记物GS没有共标;原位杂交结果表明mi R-30b与IB4,CGRP,NF200均有共标,miR-30b与Nav1.3共标。(3)双荧光素酶报告基因法验证miR-30b与SCN3A的标靶关系。利用Lipofectamine 2000共转染野生型载体pmirGLO SCN3A 3'UTR(0.5μg/mL)与不同剂量的miR-30b agomir 10 pM,50 pM,100 pM(50 nmol/L),miR-30b agomir能够剂量依赖性抑制荧光素酶活性(***P0.0001),验证了miR-30b与SCN3A有靶标关系。将野生型载体与miR-30b agomir N.C,miR-30b antagomir等mi RNAs共同转染,荧光素酶活性没有变化(P0.05),表明miR-30b agomir具有序列特异性;为近一步验证SCN3A 3'UTR的序列特异性,将突变型载体与miR-30b agomir共同转染到PC12细胞,与预期结果一致,荧光素酶活性也没有明显的改变。(4)miR-30b agomir抑制原代DRG细胞Nav1.3的表达。与正常组比较,TNF-α刺激引起原代DRG细胞Nav1.3 mRNA(***P=0.0003)和蛋白水平(***P0.0001)表达增加、miR-30b表达减少(***P=0.0007);转染miR-30b的类似物(agomir)能够翻转TNF-α诱导的Nav1.3 mRNA(#P=0.042)和蛋白水平(#P=0.0162)的高表达,并缓解miR-30b表达下调的现象(###P0.0001);另外,在正常细胞转染miR-30b的抑制剂(antagomir),Nav1.3mRNA和蛋白水平表达升高,miR-30b表达降低(*P=0.014)。以上结果表明miR-30b通过结合SCN3A 3'UTR调控Nav1.3的表达。(5)鞘内注射miR-30b agomir缓解SNL诱导的神经病理性疼痛。SNL大鼠术后10 d开始注药,连续4 d鞘内注射miR-30b agomir。注药第2d,机械痛阈和热痛阈明显升高,疼痛缓解;qRT-PCR结果表明,miR-30b agomir翻转了SNL神经损伤大鼠DRG神经元和脊髓中SCN3A表达上调及mi R-30b表达下调的趋势;western-blot数据显示,miR-30b agomir翻转了神经损伤后Nav1.3在DRG神经元(*P=0.0303)和脊髓(*P=0.0110)中的高表达。上述结果表明:鞘内注射miR-30b agomir能够缓解SNL诱导的神经病理性疼痛。在正常大鼠鞘内注射miR-30b antagomir,与注射scramble miRNA大鼠相比,miR-30b antagomir注药期间,正常大鼠机械痛阈和热痛阈显著降低,表明miR-30b antagomir诱发了痛行为;qRT-PCR和western-blot数据表明,鞘内注射miR-30b antagomir,抑制miR-30b的表达,不仅能引起Nav1.3在DRG神经元(**P=0.0011)和脊髓中(*P=0.0344)转录水平的增加,还能诱发Nav1.3在DRG神经元(*P=0.0341)和脊髓(*P=0.0309)翻译水平的增加。研究结论体内和体外实验证明,miR-30b通过结合SCN3A 3'UTR调控SCN3A的表达;SNL术后DRG和脊髓中miR-30b表达减少,Nav1.3表达升高;鞘内注射miR-30b agomir,过表达miR-30b,抑制DRG神经元和脊髓中Nav1.3的表达,缓解SNL诱导的神经病理性疼痛。MiR-30b和Nav1.3是参与神经病理性疼痛的重要分子,研究miR-30b调控Nav1.3参与神经病理性疼痛的机制,为神经病理性疼痛的治疗提供一个新的方向,为临床治疗和干预提供新的靶点和理论依据。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R402
【文章目录】：摘要
Abstract
缩略词简表
前言
第一章 SNL神经病理性疼痛模型的建立，检测疼痛状态下miR-30b和Nav1.3 的表达变化
引言
1.1 材料
1.1.1 实验动物
1.1.2 实验分组
1.1.3 实验材料
1.1.4 耗材
1.2 方法
1.2.1 SNL模型的建立
1.2.2 行为学测定
1.2.3 qRT-PCR技术
1.2.4 western-blot技术
1.2.5 免疫荧光技术
1.2.6 原位杂交技术
1.3 数据分析
1.4 结果
1.4.1 miR-30b-5p与SCN3A 3'UTR紧密相关
1.4.2 SNL神经损伤对大鼠行为学的影响
1.4.3 SNL神经病理性疼痛中Nav1.3 和miR-30b的表达变化
1.4.4 Nav1.3 在DRG神经元和脊髓的表达分布
1.4.5 miR-30b在DRG神经元和脊髓的表达分布
1.5 讨论
1.6 结论
第二章 miR-30b通过结合SCN3A 3'UTR调控Nav1.3
引言
2.1 材料
2.1.1 细胞
2.1.2 仪器
2.1.3 耗材
2.2 方法
2.2.1 PC12细胞培养及转染
2.2.2 双荧光素酶报告基因检测
2.2.3 原代DRG细胞培养及转染
2.2.4 qRT-PCR技术
2.2.5 western-blot技术
2.3 数据分析
2.4 结果
2.4.1 miR-30b靶向调控SCN3A
2.4.2 miR-30b agomir对Nav1.3 表达的影响
2.4.3 miR-30b antagomir对Nav1.3 表达的影响
2.5 讨论
2.6 结论
第三章 鞘内注射miR-30b缓解SNL诱发的神经病理性疼痛
引言
3.1 材料
3.1.1 实验动物
3.1.2 实验分组
3.1.3 主要仪器(见第一章
3.1.4 主要试剂（见第一章）
3.1.5 试剂配置（见第一章）
3.2 方法
3.2.1 SNL模型制作（见第一章）
3.2.2 蛛网膜下腔置管
3.2.3 行为学测定（见第一章）
3.2.4 qRT-PCR技术（见第一章）
3.2.5 western-blot技术（见第一章）
3.3 数据分析
3.4 结果
3.4.1 鞘内注射miR-30b agomir对SNL大鼠行为学的影响
3.4.2 鞘内注射miR-30b agomir，Nav1.3 和miR-30b的表达情况
3.4.3 鞘内注射miR-30b antagomir对正常大鼠行为的影响
3.4.4 正常大鼠鞘内注射miR-30b antagomir，Nav1.3 和miR-30b的表达情况
3.5 讨论
3.6 结论
参考文献
综述
参考文献
个人简历
致谢
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本文编号：
2886575
