乳腺癌作为一种女性常见的恶性肿瘤,它的发病率和死亡率呈现逐年上升的趋势,随着人们对放疗这一治疗方法认知的不断深入,还有放疗技术的不断提高改善以及放疗的适应范围越来越广,目前放射治疗已经成为乳腺癌的主要治疗手段之一。自噬是细胞内的一种清除受损衰老的蛋白质或细胞器的自我消化的过程,近年来自噬与癌症之间的关系成为研究热点,自噬在肿瘤的发生发展过程中是把双刃剑,既可能在缺氧或饥饿时起到保护细胞的作用,也可能发生自噬性细胞死亡。Bcl-2和腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3(BNIP3)是Bcl-2家族蛋白的一员,是一种包含BH3结构域的能编码线粒体蛋白的基因。BNIP3既能够激活细胞凋亡也能够激活细胞自噬,BNIP3的高表达与肿瘤细胞的侵袭转移以及预后密切相关。本研究着重讨论BNIP3在电离辐射诱导乳腺癌MCF-7细胞自噬中的作用,以及关于BNIP3在自噬过程中发挥作用的相关机制的研究。目的:以人乳腺癌MCF-7细胞作为研究对象,旨在研究BNIP3在电离辐射诱导的乳腺癌细胞自噬中发挥的作用以及其可能的相关机制,为肿瘤的靶向治疗提供新途径。方法:(1)本研究选用人乳腺癌MCF-7细胞作为研究对象,使用慢病毒感染液构建稳定的BNIP3沉默模型(shBNIP3)和空载体(shNC)细胞;(2)照射条件:使用X-RAD 320iX深部辐照仪进行X射线照射,电压180千伏,电流20毫安,单次源靶距70厘米,剂量率1.0 Gy/min,本实验照射剂量8Gy;(3)使用CCK8和克隆形成实验来检测细胞生存率以及辐射敏感性;(4)使用Western Blot来检测不同蛋白的表达水平,使用co-IP来检测蛋白质与蛋白质之间的相互作用;(5)使用流式细胞术来检测细胞内自噬和活性氧的表达情况;(6)使用Western Blot和RT-PCR来检测BNIP3沉默模型的沉默效果;(7)使用SPSS软件来进行统计分析,柱状图使用GraphPad软件并用均数±标准差表示,组间比较使用t检验,当P值小于0.05时认为差异具有统计学意义。结果:1.BNIP3参与电离辐射诱导的MCF-7细胞自噬给予MCF-7细胞8Gy电离辐射,CCK8结果显示,与0Gy组细胞相比,8Gy照射使细胞的生存率明显降低,并且生存率减少的趋势呈时间依赖性;MCF-7细胞经过8Gy照射后,分别在24h和48h两个时间提取细胞中的总蛋白,Western Blot检测自噬相关蛋白Beclin-1和MAPLC3及BNIP3的表达情况,结果显示,相比于未照射组,细胞经过8Gy照射后,Beclin-1、MAPLC3和BNIP3的表达均明显增加,并呈现时间依赖性,即与照射后24h组相比,照射后48h组的三种蛋白表达量更高;活性氧能够诱导自噬的发生,流式细胞术的结果表明,电离辐射不仅能导致MCF-7细胞的自噬增加,还能明显增加MCF-7细胞中的ROS水平。以上结果提示电离辐射诱导ROS产生,增加MCF-7细胞的自噬水平,并且BNIP3参与了电离辐射诱导的MCF-7细胞自噬。2.BNIP3如何调控电离辐射诱导MCF-7细胞自噬在MCF-7细胞中构建稳定的BNIP3基因沉默模型,用Western Blot和RT-PCR进行沉默效果的验证,结果显示BNIP3沉默模型建立成功,并且shBNIP3-2的沉默效果比shBNIP3-1的沉默效果要好;给予BNIP3沉默模型8Gy的电离辐射:(1)照射后使用CCK8法检测沉默BNIP3后细胞存活的情况,结果显示,照射后BNIP3沉默组细胞生存率明显高于照射后空载体组细胞的生存率,说明了沉默BNIP3能够明显降低电离辐射诱导的细胞死亡;(2)照射后使用克隆形成实验检测沉默BNIP3对于细胞辐射敏感性的影响,结果显示,与空载体组相比,沉默BNIP3能够明显降低MCF-7细胞的辐射敏感性,增加细胞对于辐射的抗性;(3)照射后使用Western Blot检测沉默BNIP3对于电离辐射诱导的细胞自噬的影响,结果显示,与空载体组相比,BNIP3沉默模型照射后,MAPLC3-II的表达水平明显增加,BNIP3的表达水平同样明显增加,说明了沉默BNIP3能够明显增加电离辐射诱导的细胞自噬;(4)流式细胞术的结果表明,电离辐射不仅能导致BNIP3沉默模型的自噬增加,还能明显增加BNIP3沉默模型中的ROS水平;(5)照射后使用Western Blot检测沉默BNIP3对于电离辐射诱导的细胞铁代谢的影响,结果显示,与空载体组相比,BNIP3沉默组照射后,Transferrin的表达水平明显升高,FTH1的表达水平明显降低,说明了BNIP3参与了铁代谢的调节,并且沉默BNIP3能够明显增加电离辐射诱导的细胞铁代谢;(6)使用Western Blot来检测线粒体膜蛋白TOM20的表达情况,沉默BNIP3后给予细胞电离辐射,TOM20的表达水平明显增加,这说明电离辐射在BNIP3沉默模型中能够诱导线粒体自噬,并且沉默BNIP3能够增加电离辐射诱导的线粒体自噬。3.MAPLC3与BNIP3介导的线粒体自噬之间的关系自噬通量(autophagy flux)的分析是反映自噬活性的可靠指标,它的检测方法通常是在细胞中加入一定浓度的NH_4Cl进行处理后检测MAPLC3-II表达量的变化情况。在BNIP3沉默模型中加入30mM浓度的NH_4Cl预处理1h后进行0Gy或8Gy剂量的照射,照射后48h使用CCK8法检测NH_4Cl对于电离辐射诱导BNIP3沉默模型中细胞死亡的影响情况,结果显示,加入NH_4Cl处理并8Gy照射的BNIP3沉默组细胞的生存率明显高于空载体组细胞,这表明NH_4Cl能够抑制电离辐射诱导的BNIP3沉默模型的细胞死亡;在BNIP3沉默模型中加入30mM浓度的NH_4Cl预处理1h后进行0Gy或8Gy剂量的照射,照射后48h使用Western Blot检测BNIP3和MAPLC3蛋白的表达情况,结果显示,加入NH_4Cl处理并8Gy照射的BNIP3沉默组细胞中BNIP3和MAPLC3蛋白的表达均明显高于空载体组细胞,以上结果提示NH_4Cl能够明显增加BNIP3和MAPLC3的表达,NH_4Cl的加入起到了自噬放大信号的作用,并且能够增加电离辐射诱导的BNIP3沉默模型中的自噬。给予BNIP3沉默模型8Gy电离辐射,照射后48h提取细胞中的总蛋白,通过免疫共沉淀(co-IP)检测BNIP3与MAPLC3之间的结合作用。Co-IP的结果提示,BNIP3通过与自噬相关蛋白MAPLC3相互结合来调控线粒体自噬,并且电离辐射能够增加BNIP3与MAPLC3的相互作用。结论:1.BNIP3能够增加电离辐射诱导的MCF-7细胞自噬。2.BNIP3能够增加电离辐射诱导的ROS表达水平。3.BNIP3能够增加电离辐射诱导的细胞铁代谢异常。4.BNIP3介导的是线粒体自噬。5.IR通过增强BNIP3与MAPLC3之间的相互作用来增加线粒体自噬。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.9;R730.55
【部分图文】：
图 1.1 线粒体选择性自噬性降解的过程癌与细胞自噬作为一种女性常见的恶性肿瘤，它具有发病率高、潜伏期特点，并且呈年轻化趋势[10]。乳腺癌的治疗与癌细胞的凋噬之间的关系复杂，自噬可能促进细胞凋亡亦可能抑制细发生发展中是自噬和凋亡共同调控癌细胞的过程[11]。许多
Matsushima 等人从胎盘 cDNA 库中分离出的一种 cDNA，它能够编码一种含有 219 个氨基酸的蛋白，其序列与 BNIP3 具有 65％同源性，因此命名为 BNIP3-like(BNIP3L)[51]或 Nip-like 蛋白 X(Nix)[52]。BNIP3L 基因定位于染色体 8p21[53]。BNIP3L 的 BH3 结构域和 TM 结构域定位于两个蛋白质之间同源性最高的区域(见图 2)，另外 BNIP3L 基因还含有 PEST 序列[54]。BNIP3L 与BNIP3 具有相近的促凋亡作用，但是在促自噬时二者有所差别：当细胞处于稳态或是受到轻微刺激时，二者均可以激活促细胞存活的自噬；但是当细胞处于应激状态时，BNIP3 诱导的线粒体自噬最终会导致细胞死亡，而 BNIP3L 并不能过度诱导线粒体自噬[55]。
第 3 章 实验结果IP3 参与电离辐射诱导的 MCF-7 细胞自噬辐射降低 MCF-7 细胞存活率究电离辐射对于人乳腺癌 MCF-7 细胞死亡的影响，给予离辐射，照射后 24h 和 48h 使用 CCK8 法检测细胞存活情值标准化为 1。结果显示，相比于未照射组，细胞经过 8G明显降低，并且随着照射后时间的延长，细胞生存率减少。这表明电离辐射能够降低 MCF-7 细胞的生存率，促进 3.1）。
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本文编号：
2889794
