伤寒沙门菌和碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的耐药机制研究

发布时间：2020-11-20 21:00

　　 目的:目前,抗生素的滥用使得多重耐药菌正日益增多,威胁着人类的健康。多重耐药的伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi,S.Typhi)和碳青霉烯类耐药肠杆菌(Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae,CRE)是可以引起人类严重感染甚至致命的两类细菌,了解它们的耐药机制对临床感染的预防和监控具有十分重要的意义。本文首先围绕传统细菌耐药调节子Ram R及Ram A在伤寒沙门菌中的功能展开研究,旨在探究两者在伤寒沙门菌耐受氨苄西林中的作用。另外,由于近年来碳青霉烯类抗生素在临床上的广泛使用,使得CRE菌株在全球蔓延,本文拟通过分析中国东部苏州地区的CRE分子流行病学特征,为本地区CRE感染的治疗和监控提供有力的理论依据。近年来,质粒介导的多粘菌素耐药基因mcr-1的发现并蔓延至CRE菌株预示着泛耐药菌的出现,引起了全球关注,本文拟分析来自我国六个不同地区的CRE菌株携带mcr-1的分子特性及其表达特征,为mcr-1耐药机制的深入研究奠定基础。方法:一、伤寒沙门菌中ramR及ramA对氨苄西林的耐药调控功能研究1、ramR基因缺陷株的制备:PCR扩增ramR上下游基因片段F1、F2,再将F1和F2连接成ramR的缺损片段F3,将F3与自杀质粒p GMB151连接以构建重组载体,并电转至S.Typhi野生株GIFU10007,利用自杀质粒上sac B基因特性筛选ramR基因缺陷变异株(ΔramR)。2、ramA基因高表达株及空质粒对照株的制备:扩增ramA基因片段并克隆至高表达质粒p BAD33中,分别将重组质粒p BAD33-ramA和空质粒p BAD33电转至GIFU10007,即分别为ramA高表达株GIFU10007(p BAD33ramA)和空质粒对照株GIFU10007(p BAD33)。3、氨苄西林压力下ΔramR和GIFU10007(p BAD33ramA)中ramA的表达分析:分别提取伤寒沙门菌GIFU10007、ΔramR、GIFU10007(p BAD33ramA)和GIFU10007(p BAD33)在氨苄西林应激30min后的总RNA,利用q RT-PCR技术测定各菌株中ramA的表达水平,并比较它们的表达差异。4、氨苄西林应激下细菌生长曲线的测定:分别测定伤寒沙门菌GIFU10007、ΔramR、GIFU10007(p BAD33ramA)和GIFU10007(p BAD33)在氨苄西林应激条件下的生长曲线,比较其生长差异,即对氨苄西林的耐受度差异。二、苏州地区CRE临床菌株的耐药分子流行病学分析1、菌株鉴定和药敏分析:用Phoenix-100(BD)全自动微生物分析仪对收集的CRE菌株进行菌种鉴定和药敏分析,并通过PCR扩增16S r RNA和测序比对进行菌种验证。2、耐药基因的筛选:采用PCR法筛选碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaNDM、blaVIM、bla IMP、blaOXA-48)、超广谱β-内酰胺酶基因(blaCTX-M、blaSHV、blaTEM)、Amp C头孢菌素酶基因(blaCMY、blaACT、blaDHA)和孔道蛋白基因(omp K35/omp F、omp K36/omp C)等,结果经测序鉴定。3、多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST):PCR扩增大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠杆菌属的看家基因,并进行双向测序,将基因序列上传至MLST数据库网站后获得Sequence Type(ST)分型结果。4、脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)分析:经上述MLST分析未获得ST分型的菌株,利用PFGE技术进行分析,调查CRE临床分离株的流行病学相关性。5、质粒接合转移实验:将受体菌和产碳青霉烯酶的供体菌混合培养进行接合转移试验,再通过PCR法筛选出阳性接合转移子。6、S1-PFGE:挑取携带blaKPC的质粒接合转移子进行S1-PFGE实验,分析blaKPC整合质粒的分子特征。7、质粒序列分析:挑取具有代表性的碳青霉烯酶基因整合的质粒接合转移子进行质粒序列测定分析。三、多地区CRE菌株合并多粘菌素耐药基因mcr-1的相关研究1、耐药基因分析:首先PCR筛选多地区收集的CRE临床分离株中粘菌素耐药基因mcr-1,然后对mcr-1阳性的菌株进行碳青霉烯酶基因等其它耐药基因分析。2、MLST分析:同上述2.3方法,对携带mcr-1的CRE菌株进行MLST分析。3、质粒接合转移实验:以mcr-1阳性的CRE菌株为供体菌,方法同2.5。4、药敏试验:用Phoenix-100(BD)对mcr-1阳性的CRE菌株及其接合转移子进行药敏分析,分析其抗性谱特征。5、基于PCR的质粒复制子分型(PCR-based Replicon Typing,PBRT):根据质粒复制子的不同类型,可以将质粒分为18个不相容质粒群和Inc X、Inc I2,通过PCR扩增对携带mcr-1的质粒进行分型。6、质粒序列测定和全基因组序列测定:提取质粒接合转移子中不同类型的质粒进行质粒序列测定,无法获得接合转移子的mcr-1阳性的临床菌进行全基因组序列分析。7、临床菌株中mcr-1的表达水平分析:在无任何应激条件下提取各CRE临床菌的总RNA,采用绝对定量法进行荧光定量PCR,分析各CRE菌株中mcr-1的基础表达水平。8、多粘菌素应激下临床菌株中mcr-1的表达水平变化分析:用多粘菌素分别刺激20min和120min,采用绝对定量荧光PCR法测定mcr-1的表达量,分析不同菌株在应激不同时刻时mcr-1的表达差异。9、多粘菌素应激下接合转移子中mcr-1的表达水平变化分析:用多粘菌素分别应激mcr-1接合转移子20min和120min,进行绝对定量荧光PCR,分析在相同遗传背景中mcr-1的表达变化。10、含mcr-1临床菌株及其接合转移子的多粘菌素MIC测定:采用常量肉汤稀释法进行多粘菌素MIC测定,分析多粘菌素的MIC值与mcr-1的表达水平是否相关。结果:一、伤寒沙门菌中ramR及ramA对氨苄西林的耐药调控功能研究1、成功制备伤寒沙门菌ΔramR、GIFU10007(p BAD33ramA)及GIFU10007(p BAD33)。2、在氨苄西林压力下,GIFU10007(p BAD33ramA)的ramA表达量是GIFU10007(p BAD33)的43倍,而ΔramR和GIFU10007中ramA的表达水平没有统计学差异。3、氨苄西林应压力下,GIFU10007(p BAD33ramA)的生长明显优于GIFU10007(p BAD33),ΔramR和GIFU10007生长速度没有差异。二、苏州地区CRE临床菌株的耐药分子流行病学分析1、本研究共收集到苏州CRE70株,其中40株肺炎克雷伯菌分属于至少10种不同的STs,以ST11最常见;2株产酸克雷伯菌属于不同的STs;7株肠杆菌属细菌检出3个不同的STs;3株大肠杆菌的STs各不相同;15株粘质沙雷菌可分成两种主要的PFGE型带,而2株解鸟氨酸克雷伯菌的PFGE带型各不相同。共鉴定出52株产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌(Carbapenem-Producing Enterobacteriaceae,CPE),含bla KPC-2(n=42)、blaKPC-3(n=1)、blaNDM-1(n=6)、blaNDM-5(n=1)、blaIMP-4(n=3)和blaVIM(n=2);54株CRE产ESBLs和/或Amp C,包括blaTEM(n=42)、blaSHV(n=26)、bla CTX-M(n=50)、blaDHA(n=19)、blaCMY(n=2)和blaACT(n=2);20株CRE的孔蛋白基因发生了突变;2、本实验获得了15株blaKPC阳性的质粒接合转移子,包括blaKPC-2和blaKPC-3的接合转移子,以及p NDM_E600、p IMP_E600和p VIM_E600接合转移子。其中携带blaKPC的质粒至少有3种,其长度分别为~70kb、~95kb、~130kb、~150kb,其中最多的是~95kb长度的质粒,为Inc F质粒,携带blaNDM-1、blaNDM-5、blaIMP-4和blaVIM的质粒分别为Inc A/C、Inc X3、Inc H和Inc I1质粒。blaKPC-2由NTEKPC-1a p Kp048样元件所携带,而blaKPC-3由一种新型的NTEKPC-II元件所携带,并在blaKPC-3上游94bp处插入了blaTEM。blaNDM-1镶嵌于1类整合子中,从而形成了一种新型的移动元件。三、多地区CRE菌株合并多粘菌素耐药基因mcr-1的相关研究1、从多地区CRE菌株中获得5株mcr-1阳性的大肠埃希菌,分别为苏州的SZ01(ST2448)、SZ02(ST2085)、成都的CDA6(ST167)、北京的BJ10(ST156)、BJ13(ST457),2株含mcr-1的肺炎克雷伯菌,即苏州的SZ03(ST25)、SZ04(ST25),及其接合转移子SZ01-mcr-1-E600、SZ02-mcr-1-E600、CDA6-mcr-1-J53、BJ13-mcr-1-J53、SZ03-mcr-1-J53、SZ04-mcr-1-J53,但未获得BJ10的接合转移子。SZ01、CDA6、SZ03和SZ04中mcr-1整合的质粒均为Inc X4质粒,即p MCR1_Inc X4;SZ02和BJ13中携带mcr-1的质粒均为Inc I2,即p MCR1_Inc I2。所有携带mcr-1的质粒均有相同的2.6 kb长的mcr-1-pap2基因簇结构;E.coli BJ10中mcr-1位于染色体内Tn9样复合转座子中(暂命名为Tn Apl)。2、携带多粘菌素耐药基因mcr-1的CRE临床分离株,在没有多粘菌素作用的条件下,p MCR1_Inc X4携带的mcr-1表达水平介于1.81×10-5至1.05×10-4(pmol/μg总RNA)之间,p MCR1_Inc I2的mcr-1表达水平分别为5.27×10-5(SZ02)和2.58×10-5(BJ13)(pmol/μg总RNA)。另外,BJ10中染色体mcr-1的表达量为5.49×10-5(pmol/μg总RNA)。3、携带p MCR1_Inc X4的CRE临床菌株在多粘菌素作用20min和120min后,其表达量分别增加了2倍和4倍;其中,特别是的SZ01在多粘菌素作用20min后其表达降低,但在作用120min后其表达又恢复到了基线水平;SZ02、BJ13中的p MCR1_Inc I2和BJ10的染色体中mcr-1的表达量在20min和120min后均保持在基线水平。4、p MCR1_Inc X4和p MCR1_Inc I2在大肠杆菌E600中的mcr-1表达水平相似,并在粘菌素刺激20min后降低,而120分钟后p MCR1_Inc X4中的mcr-1表达上调,而p MCR1_Inc I2中的mcr-1下调。结论:1、伤寒沙门菌中ramA高表达时可增强细菌对氨苄西林的抗性;ramR既不抑制ramA的转录表达,也不参与ramA对氨苄西林的耐药调控过程,这点不同于其他细菌。2、苏州地区CRE菌株的细菌种类和STs较丰富,且其耐药机制如碳青霉烯酶、ESBLs、Amp C、突变孔蛋白、质粒等具有显著的多样性。3、携带mcr-1的CRE菌株已开始在中国不同地区的医院传播,且本研究首次报道了mcr-1整合于染色体的CRE,同时,研究发现几乎所有携带mcr-1的质粒均含有长为2.6 kb的mcr-1-pap2基因簇结构。此外,在多粘菌素应激下,mcr-1在不同质粒和不同遗传背景的细菌宿主中具有不同的表达特征,提示其表达调控较复杂,有待进一步深入研究。
【学位单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R446.5
【部分图文】：

9.1绝对定量PCR中mcr-1的融解峰Fig3.3.9.1Themeltpeakofmcr-1inabsolutequantitativePCR

认为 P<0.5 时有统计学差异。结果如图3.3.9.3 所示，在两株肺炎克雷伯菌 SZ03 和 SZ04（均为 ST25）以及两株大肠埃希菌CDA6（ST167）和 SZ01（ST2448）的质粒 pMCR1_IncX4 中，mcr-1 表达水平在 1.81×10-5~1.05×10-4（pmol/μg 总 RNA）之间，其中表达水平最高的是 CDA6。E. coli SZ02（ST2085）和 BJ13（ST457）中 pMCR1_IncI2 的 mcr-1 表达水平分别为 5.27×10-5和 2.58×10-5（pmol/μg 总 RNA）。E. coli BJ10（ST156）的染色体 mcr-1 的表达水平58

认为 P<0.5 时有统计学差异。结果如图3.3.9.3 所示，在两株肺炎克雷伯菌 SZ03 和 SZ04（均为 ST25）以及两株大肠埃希菌CDA6（ST167）和 SZ01（ST2448）的质粒 pMCR1_IncX4 中，mcr-1 表达水平在 1.81×10-5~1.05×10-4（pmol/μg 总 RNA）之间，其中表达水平最高的是 CDA6。E. coli SZ02（ST2085）和 BJ13（ST457）中 pMCR1_IncI2 的 mcr-1 表达水平分别为 5.27×10-5和 2.58×10-5（pmol/μg 总 RNA）。E. coli BJ10（ST156）的染色体 mcr-1 的表达水平58
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本文编号：2891988