树枝状高分子PAMAM衍生物介导miR-23b递送治疗肿瘤和类风湿性关节炎的研究

发布时间：2020-11-21 18:29

　　 基因治疗(Gene therapy)是利用基因转移技术将治疗基因导入靶组织或靶细胞,纠正或改善异常表达的基因,恢复其正常的生物学功能,从而达到治疗疾病的目的。在治疗基因的选择中,具有RNA干扰能力的microRNA(miRNA)分子由于其胞内精准靶向识别的优势,在重大疾病的发生发展中扮演着重要的角色,已经成为多种疾病基因治疗的焦点。miRNA是一类非编码单链小分子RNA,长度约21-23个核苷酸,能够通过靶基因mRNA的降解及单纯抑制翻译过程两条途径来降低靶基因的表达水平。在miRNA下调或缺失所引发的疾病中,通过递送相关的miRNA模拟物(miRNA mimics)来恢复靶组织或靶细胞中正常miRNA表达水平,实现与内源miRNA相同的生物学功能,能一定程度上缓解疾病,阻止疾病的发生发展,具有较高的医学前景。然而,小核酸自身不够稳定,易被血液中核酸酶降解;同时,其本身负电荷不容易被细胞摄取。因此,小核酸miRNA必须依赖高效的基因递送系统才能实现作为基因药物的疗效,发挥其生物学功能。目前,常用的基因传输载体主要分为病毒类基因传输载体以及非病毒类基因传输载体。然而,病毒类载体存在严重的免疫原性,极大限制其在基因领域的应用。相比之下,非病毒类基因传输载体具有更低的细胞毒性,免疫原性以及生产简单的特点,因此备受关注。在这一类载体中,树枝状高分子聚酰胺-胺(PAMAM)由于其独特的性质而得到广泛研究,具体原因如下:首先,PAMAM最外层氨基提供高密度的阳离子电荷,可以有效结合组装核酸分子。其次,在小核酸药物递送中,核酸分子与树枝状高分子形成稳定复合物能保护核酸分子免受核酸酶的降解。第三,树枝状高分子PAMAM结构中含有大量的三级胺,能通过“质子海绵”效应加快纳米复合物实现内涵体逃逸。此外,树枝状高分子的多氨基的表面适合多功能化修饰。比如:外层氨基被修饰靶向配体,能加速载体被靶器官或靶细胞胞吞过程。因此,树枝状高分子PAMAM的特殊的物理化学性质使其优于其他线性的高分子材料,在核酸类药物递送体系中能发挥更大的潜力。虽然如此,PAMAM的转染效率依旧不尽如人意,其具有较高的细胞毒性更是限制其在基因递送领域的应用。因此,针对上述问题,我们利用碱基修饰及氟化修饰的手段对PAMAM表面最外层氨基进行修饰,构建一类高效、低毒的PAMAM衍生物递送体系,并实现小核酸miRNA在体内及胞内的精准递送。具体研究内容与结果如下:1.碱基修饰型树枝状高分子介导miR-23b递送治疗肺癌的研究癌症是世界关注的公共卫生问题,其中肺癌是最常见的恶性肿瘤之一。到目前为止,手术依旧是治疗肺癌的主要手段,但术后肿瘤转移依旧会导致治疗失败。而基于小核酸miRNA基因治疗手段能从基因层面上抑制肿瘤增殖,迁移,因此成为癌症治疗的新选择。在本章中,利用2-氨基-6-氯嘌呤修饰PAMAM,成功构建了碱基修饰型树枝状高分子AP-PAMAM。经过修饰后的AP-PAMAM能通过氢键相互作用,调节与核酸分子的结合与释放,大幅度提高了其转染效率。此外,由于最外层氨基被屏蔽,AP-PAMAM正电荷下降,导致其细胞毒性也随之下降。接着,以AP-PAMAM作为基因载体,成功的实现了miR-23b在肺癌细胞A549的递送,并通过诱导细胞凋亡及周期阻滞,有效的抑制了肿瘤细胞的增殖。经过纳米复合物转染后,miR-23b在肿瘤细胞内同时激活线粒体依赖的凋亡途径以及死亡受体依赖的凋亡途径,诱导细胞发生凋亡。不仅如此,miR-23b的胞内递送还能降低致癌蛋白Bcl-2和Survivin的表达同时提高抑癌蛋白PTEN水平。除了诱导凋亡以外,miR-23b还能下调Cyclin D1的表达,导致肿瘤细胞阻滞在S期。与此同时,经过小核酸miR-23b递送后,与肿瘤转移密切相关的蛋白MMP-9表达量明显被抑制,因此产生了抗肿瘤迁移和浸润的能力。总之,碱基修饰型PAMAM载体介导miR-23b递送有望成为肿瘤基因治疗的新的手段。2.氟化修饰型树枝状高分子介导miR-23b递送治疗类风湿性关节炎的研究在类风湿性关节炎发病过程中,过度的炎症因子释放以及炎症患处缺乏必要的细胞凋亡能加剧疾病的恶化。因此,针对凋亡及炎症反应设计miRNA递送系统有望缓解并治疗这一疾病。在这一章中,我们通过氟化修饰方法构建了氟化修饰型PAMAM载体FP,进行miR-23b的高效递送。以小鼠巨噬细胞RAW264.7为模型,FP/miR-23b能有效激活线粒体凋亡途径来诱导巨噬细胞发生凋亡。与此同时,miR-23b还通过靶向IKK-α,TAB2以及TAB3,来抑制NF-κB信号通路网络,从而降低促炎症因子TNF-α,IL-1β和IL-6的表达。由此说明,miR-23b可以通过抗炎及抗增殖的协同效应,实现抑制炎症的根本目的,为类风湿性关节炎治疗提供理论基础。随后,利用佐剂诱导关节炎大鼠模型来评价FP/miR-23b纳米复合物的治疗效果。经过治疗后,纳米复合物能通过ELVIS效应滞留在患病关节处,从而提高关节内miR-23b的表达量。不仅如此,在经过治疗的关节炎大鼠的关节内,滑膜组织浸润的现象得到明显抑制,患病关节及血清内的促炎因子的表达量都下降或恢复到正常水平,体现了FP/miR-23b纳米复合物具有减缓炎症,抑制骨组织侵蚀,并改善大鼠运动能力的治疗效果。最后,在正常大鼠体内,FP/miR-23b纳米复合物并未表现出明显的肾脏及肝脏毒性,说明其具有良好的生物相容性,有利于临床开发及应用。以上结果说明,氟化修饰型PAMAM介导的小核酸递送能通过诱导细胞凋亡以及抑制炎症反应的协同效应来实现类风湿性关节炎的治疗,为类风湿性关节炎及其他自身免疫疾病的基因治疗的提供了新的启示。综上,我们构建了一类高效低毒的小核酸递送载体,能有效帮助小核酸递送至不同疾病模型中,并精准识别胞内靶点,发挥其治疗功能,为基于小核酸所构建的重大疾病纳米药物设计与评价提供了新的思路。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R450
【部分图文】：

基因治疗发展史概况[9]

图 1.3 miRNA 的产生及 RNA 干扰的机理越来越多的研究报道了 miRNA 异常表达与疾病的发、中枢神经系统疾病、心血管疾病以及自身免疫性疾RNA 表达异常而开发出的基因治疗对于治疗疾病有着

骨和软骨的病理损伤。关节骨和软骨的连接处，往往会形RA 中另一个重要的病理现象，也是要特征之一（图 1.5）[90]。血管翳的软组织，导致关节畸形，最终功增生往往伴随着新生血管的形成，，同时也促进了血管翳的生成和维透性增强，产生了类似肿瘤组织血（ extravasation through leaky vasiated sequestration，ELVIS）（图 1、脂质体、胶束等纳米给药系统，释放药物而发挥靶向和长效治疗作
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本文编号：2893419