H1细胞诱导成肌细胞及DMD基因50-51号外显子敲除的初步研究

发布时间：2020-12-10 19:35

　　背景杜氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy,DMD）是男性儿童时期最常见的致死性X连锁隐性遗传病,主要致病原因为DMD基因突变,临床上尚无有效的治疗手段,主要通过糖皮质激素的应用来延缓病情。目前DMD的治疗研究重点已深入到基因治疗水平。在外显子51存在的情况下,通过敲除或跳跃第51外显子,可以使13%的DMD患者变为BMD从而延缓病情。DMD患者来源的iPSC是进行DMD疾病研究的模型,也是治疗效果评价的较好的模型,通过CRISPR/Cas9对DMD等单基因遗传病患者来源的iPSCs进行基因修饰,可获得同一来源遗传背景一致的未修饰的患病细胞及修饰过的对照组的细胞。然而在临床上获得适合Exon51外显子敲除的DMD患胎来源的iPSC较为困难。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对正常人来源的H1细胞诱导的成肌细胞进行基因修饰,将其变成适合Exon51外显子敲除的突变细胞类型,然后进行基因修饰研究是一个合理的解决办法。本实验中,使用CRISPR/Cas9技术构建DMD基因Exon50缺失的H1细胞来源的成肌细胞系,并将DMD基因Exon51进行靶向敲除,通... 

【文章来源】：郑州大学河南省 211工程院校

【文章页数】：74 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

MSC样细胞分化流程图

验结果gRNA 活性检测序列经 Cas9/sgRNA 切割后由于缺乏修复模板，将主要以非）的方式进行随机修复，或多或少会插入或删除一些碱基。因 扩增后经变性、退火，将形成错配。错配酶（主要是 CEL1 或配的杂合双链并剪切。将产物进行凝胶电泳，就可以通过比割条带的比例，即可反映出 Cas/sgRNA 的活性（见图 2）。

图 3 A1-A4：流式细胞仪筛选后，显微镜下挑选绿色荧光强的克隆每次传代后的白色荧光下（100×）的 H1 细胞图片；B1-B4：白色荧光相对应的同视野下绿色荧光图（100×）。经过数次挑克隆传代，在绿色荧光显微镜下显示 H1 细胞绿色荧光区域接近100%。（2）H1 敲除鉴定在筛选到可稳定传代的＞90%绿色荧光遗传的 H1 细胞后，提取 H1 细胞基因组行 DMD 基因 MLPA 检测其 Exon50 外显子缺失情况（见图 4）。


本文编号：2909258