通辽地区大肠埃希菌耐药分析及其生物膜形成与Ⅰ类整合子相关性的研究

发布时间：2017-04-10 08:03

  本文关键词：通辽地区大肠埃希菌耐药分析及其生物膜形成与Ⅰ类整合子相关性的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景及目的:大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)是栖居在人和动物肠道中正常菌群的重要成员之一,同时也是一种机会致病菌,可以引发肠道外感染包括泌尿道感染、血液感染以及脑膜炎等。2014年WHO全球抗生素耐药监测报告指出,在全球114个国家中大肠埃希菌对于第三代头孢菌素以及氟喹诺酮类药物的耐药性已经达到了很高的水平。了解临床感染的大肠埃希菌耐药现状,可以优化抗菌药物的使用,为临床治疗提供指导;细菌生物膜(Bacterial Biofilm,BBF)是指细菌粘附于接触物表面,分泌大量细胞外聚合物,包括肽聚糖、纤维蛋白和磷脂等,并将细胞自身包绕其中而形成的膜样物。生物膜状态下的细菌,其基因表型发生改变,可以产生较高的耐药性;Ⅰ类整合子(Int1)是革兰阴性菌临床分离株中最常见的整合子,可以将捕获的外源耐药基因转变为功能性的表达单位,从而表达出对某一药物的抗性。另一方面,不同的耐药基因又可以插入同一个Ⅰ类整合子中,介导多重耐药株的形成。本研究旨在分析通辽地区某医院临床分离大肠埃希菌的耐药情况,了解Ⅰ类整合子的分布状况,并对细菌生物膜状态和浮游状态下的Ⅰ类整合酶基因(int I1)的表达情况进行分析,初步探讨生物膜形成与Ⅰ类整合子的相关关系。材料及方法:99株临床分离大肠埃希菌收集于2013年10月至2014年3月通辽市某三级甲等医院,纸片扩散法分析其耐药情况;微孔板法检测99株大肠埃希菌生物膜形成能力,分析生物膜形成能力与耐药性之间的关系;设计Ⅰ类整合酶基因和可变区上下游引物,PCR检测99株大肠埃希菌Ⅰ类整合子的携带情况,高通量测序分析整合子携带耐药基因盒的类型;在温度、湿度等相同实验条件下分别培养浮游状态和生物膜状态的细菌,提取两种状态下的细菌总RNA,实时定量PCR分别测定Ⅰ类整合酶基因在浮游状态和生物膜状态下的表达情况。结果及结论:药敏实验结果及耐药数据分析表明,99株临床分离的大肠埃希菌耐药程度较高,在23种抗生素中有13种抗生素的耐药率超过50%,亚胺培南和美罗培南的耐药率最低,分别为7%和5%;微孔板法显示,99株大肠埃希菌普遍可以形成生物膜,但各菌株形成生物膜的能力差别较大。统计学分析显示,菌株形成生物膜能力的强弱,与菌株对阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南三种抗生素耐药率的高低有相关性;在99株大肠埃希菌中Ⅰ类整合酶阳性菌株共有55株,阳性率为55.6%,其中携带Ⅰ类整合子相关基因盒的菌株共有36株,携带率为36.4%,所检测四株菌株主要携带arr-3、dfr A27、dfr A17和Aad A5四种类型基因盒,其中一株携带arr-3--dfr A27的组合形式,三株携带dfr A17--Aad A5的组合形式;细菌在浮游状态和生物膜状态均有Ⅰ类整合酶基因表达,但两种状态下Ⅰ类整合酶基因m RNA转录水平不同,Ⅰ类整合酶基因在生物膜状态下表达水平有显著增高。
【关键词】：大肠埃希菌 抗生素耐药 生物膜 Ⅰ类整合子 实时定量PCR
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R446.5
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文缩写词表11-12
• 第一章 绪论12-19
• 1 临床分离大肠埃希菌及其耐药性现状12
• 1.1 大肠埃希菌概述12
• 1.2 大肠埃希菌的耐药现状12
• 2 生物膜与细菌耐药12-14
• 2.1 细菌生物膜概述12-13
• 2.2 EPS的屏障作用13
• 2.3 生物膜的营养限制和特殊微环境学说13-14
• 2.4 细菌群体感应系统（Quorum sensing, QS）14
• 2.5 生物膜中基因表型的改变14
• 3 整合子-基因盒与细菌耐药14-18
• 3.1 整合子的结构与分类15-16
• 3.2 耐药基因盒的结构16
• 3.3 耐药基因盒的几种类型16-17
• 3.4 整合子检测方法17-18
• 4 细菌生物膜与整合子关联猜想18-19
• 4.1 应激反应（SOS）18
• 4.2 耐药基因的水平传递18-19
• 第二章 实验研究19-33
• 1 实验材料19-21
• 1.1 菌株来源19
• 1.2 实验试剂与耗材19-21
• 1.3 主要实验仪器21
• 1.4 数据分析及统计学软件21
• 2 实验方法21-33
• 2.1 99株临床分离大肠埃希菌的耐药情况分析21-23
• 2.2 99株大肠埃希菌生物膜形成能力及Ⅰ类整合子的相关研究23-27
• 2.3 大肠埃希菌Ⅰ类整合酶基因在生物膜转录水平的研究27-33
• 第三章 实验结果33-50
• 1 大肠埃希菌临床分离株耐药情况分析33-37
• 1.1 细菌的分离鉴定33
• 1.2 生长曲线的绘制33-34
• 1.3 药敏试验结果34-36
• 1.4 耐药结果的可视化分析36-37
• 2 大肠埃希菌生物膜形成能力及Ⅰ类整合子的相关研究37-44
• 2.1 大肠埃希菌生物膜模型的建立与鉴定37-38
• 2.2 99株大肠埃希菌生物膜形成能力的定量分析38-40
• 2.3 大肠埃希菌生物膜形成能力与耐药性的相关性分析40
• 2.4 PCR筛选Ⅰ类整合酶基因40
• 2.5 PCR筛选Ⅰ类整合子相关基因盒40-41
• 2.6 携带Ⅰ类整合子基因盒菌株的耐药情况41-42
• 2.7 Ⅰ类整合子携带基因盒序列分析42-44
• 3 大肠埃希菌Ⅰ类整合酶基因在生物膜转录水平的研究44-50
• 3.1 大肠埃希菌生物膜和浮游状态RNA提取44-45
• 3.2 大肠埃希菌生物膜和浮游状态mRNA的定性检测45-46
• 3.3 Ⅰ类整合酶基因在生物膜状态和浮游状态下mRNA表达水平差异比较46-50
• 第四章 讨论50-53
• 第五章 结论53-54
• 参考文献54-61
• 作者简介61-62
• 致谢62

【参考文献】

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本文编号：296237