高致病性禽流感病毒快速诊断关键技术的探索

发布时间：2021-02-17 03:10

　　研究背景高致病性禽流感是由正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的以禽类为主的烈性传染病,它具有暴发突然、感染性强、病程进展迅速和死亡率高的特点,一旦大面积暴发往往会伴随巨大经济损失。当前针对H7N9、H5N1等高致病性禽流感病毒感染检测与确诊的主要手段是逆转录聚合酶链式反应技术,此技术存在高成本、操作复杂和需要受过专业技术培训人员等要求,样本需要经过采集、集中、提纯等处理程序,增加了病毒扩散的几率,延长了获得检测结果的时间,往往需要一天以上才能得到检测结果。现存检测方法无论是血清学检测技术还是分子生物学检测技术,在应对当前禽流感集中暴发与长期散发交替、大量隐性感染与少数发病感染并存、易感人群普通市民和偏远乡村居民并存的疫情现状时有些滞后和困难,往往造成疫情拖延和治疗延误,甚至引燃疫情爆发。因此,研发一种操作简便、检测快速、价格相对低廉的检测高致病性禽流感病毒的方法具有非常重要的现实意义。研究目的本课题组拟研发一种高致病禽流感病毒快速检测便携式诊断试剂盒,涉及高致病性禽流感病毒捕获、滚环扩增、自生成引物滚环扩增和可视化显色等关键技术。本研究以滚环扩增技术为基础,探索自生成引物滚环扩增的快... 

【文章来源】：华侨大学福建省

【文章页数】：92 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 引言
    1.1 禽流感病毒
        1.1.1 禽流感简介
        1.1.2 禽流感病毒的结构分类及功能
    1.2 流感病毒分子生物学检测技术
        1.2.1 基于PCR的检测技术
        1.2.2 基于核酸序列的检测技术
        1.2.3 基于环介导等温扩增的检测技术
    1.3 滚环扩增技术的分类和特性
        1.3.1 线性和指数滚环扩增
        1.3.2 锁式探针滚环扩增
        1.3.3 自生成引物滚环扩增
    1.4 适体概述
    1.5 可视化检测
    1.6 本课题来源、研究思路与内容
        1.6.1 本课题的来源与研究意义
        1.6.2 本课题的研究思路
        1.6.3 本课题的主要内容
第2章 滚环扩增方法的研究
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验试剂与耗材
        2.1.2 试剂配制
    2.2 检测技术通用步骤
        2.2.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
        2.2.2 琼脂糖核酸电泳
    2.3 最佳成环条件探索
    2.4 最佳扩增条件探索
        2.4.1 bstDNA聚合酶和phi29DNA聚合酶扩增效果比较
        2.4.2 环用量探索
        2.4.3 检测时间和灵敏度优化
    2.5 H7N9特征基因检测
        2.5.1 H7N9特征基因的获取
        2.5.2 锁式探针成环检测H7N9特征基因
    2.6 结果与分析
        2.6.1 最佳成环条件分析
        2.6.2 最佳扩增条件分析
        2.6.3 H7N9检测验证分析
    2.7 小结和讨论
        2.7.1 小结
        2.7.2 讨论
第3章 自生成引物滚环扩增方法的研究
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验试剂与耗材
        3.1.2 试剂配制
    3.2 引物三通PG-RCA可行性分析
    3.3 引物三通PG-RCA扩增条件优化
        3.3.1 改变扩增体系buffer
        3.3.2 降低dNTP和酶浓度
        3.3.3 稀释模板浓度、探针浓度和酶浓度
        3.3.4 改变bst和Nb.Bsml的比例和用量
        3.3.5 改变探针序列
    3.4 PG-RCA影响因素探索
        3.4.1 排查PG-RCA影响因素
        3.4.2 换用限制性切口酶
    3.5 结果与分析
        3.5.1 PG-RCA可行性分析
        3.5.2 PG-RCA扩增条件优化分析
        3.5.3 PG-RCA影响因素分析
    3.6 小结和讨论
        3.6.1 小结
        3.6.2 讨论
第4章 可视化检测
    4.1 实验材料
        4.1.1 实验试剂与耗材
        4.1.2 试剂配制
    4.2 HNB和EBT显色条件探索
2+浓度和pH对显色的影响">        4.2.1 Mg²⁺浓度和pH对显色的影响
        4.2.2 dNTP浓度对显色的影响
    4.3 扩增反应验证最佳显色条件
2+和dNTP浓度探索">        4.3.1 最佳Mg²⁺和dNTP浓度探索
        4.3.2 验证最佳显色条件
    4.4 用HNB显色法检测RCA扩增的特异性和灵敏度
        4.4.1 特异性检测
        4.4.2 检测限探索
    4.5 结果与分析
        4.5.1 显色条件探索结果
        4.5.2 扩增反应探索最佳条件
        4.5.3 RCA扩增技术特异性和检测限分析
    4.6 小结和讨论
        4.6.1 小结
        4.6.2 讨论
第5章 适体初探
    5.1 实验材料
        5.1.1 实验试剂与耗材
        5.1.2 试剂配制
    5.2 石英晶体微天平通用步骤
    5.3 方案设计
        5.3.1 检测病毒方案设计
        5.3.2 找寻合适适体
        5.3.3 初步鉴定方案的可行性
    5.4 检测适体和靶标结合力
        5.4.1 凝胶阻滞验证
        5.4.2 石英晶体微天平验证
    5.5 结果与分析
        5.5.1 初步分析方案的可行性
        5.5.2 凝胶阻滞实验分析
        5.5.3 石英晶体微天平实验分析
    5.6 小结和讨论
        5.6.1 小结
        5.6.2 讨论
第6章 结论
    6.1 研究总结
    6.2 创新点
    6.3 需进一步开展的研究
参考文献
致谢
个人简历及研究成果


【参考文献】：
期刊论文
[1]A型流感病毒研究进展[J]. 邹积振,程凯慧,陈为京,于志君.  安徽农业科学. 2017(32)
[2]H7N9禽流感及相关疫情分析评估[J]. 林丹,谢剑锋,严延生.  中国人兽共患病学报. 2017(03)
[3]核酸适体的筛选及其在生物医学领域的研究进展[J]. 靳贵晓,李娟,杨黄浩.  福州大学学报(自然科学版). 2016(06)
[4]甲型流感病毒NS1、NS2和NS3蛋白的研究进展[J]. 谭伟,谢芝勋.  畜牧兽医学报. 2014(12)
[5]禽流感病毒基因组及其编码蛋白的结构与功能[J]. 司振书,王守山,胡冬民.  广东农业科学. 2012(01)
[6]核酸适体在生物医学中的应用[J]. 吴崔晨,胡佳,邹远,王驰,刘杰,杨朝勇.  化学进展. 2010(08)

博士论文
[1]禽流感疫情冲击下养殖户经济损失评价及补偿政策优化研究[D]. 刘明月.西北农林科技大学 2017

硕士论文
[1]H7N9疫情对家禽产业的影响[D]. 夏云.华南农业大学 2016



本文编号：3037332