澳洲坚果过敏原免疫分析方法的建立与应用

发布时间：2021-02-19 08:57

　　澳洲坚果属树类坚果,具有很高的营养价值,但是其过敏原蛋白能够引起部分人群产生过敏反应。目前防止过敏的有效方法是避免过敏人群对过敏原的接触,因此,建立澳洲坚果蛋白的有效检测方法具有重要意义。本论文优化建立了澳洲坚果全蛋白的酶联免疫检测方法,并应用于热加工食品中日的蛋白的检测。采用硫酸铵沉淀法提取澳洲坚果全蛋白,并将其作为抗原免疫新西兰大白兔和BALB/c小鼠制备兔多克隆抗体和鼠多克隆抗体。交叉反应实验表明,所制备抗体除能识别开心果和榛果的部分蛋白外,与大豆、核桃、杏仁、花生、腰果和小麦中的蛋白均没有识别,说明所制备抗体特异性较好。利用兔多克隆抗体优化建立了间接竞争酶联免疫方法,抗原包被量为0.025μg/well,封闭液为1%脱脂乳粉,兔抗稀释倍数为1:16000,羊抗兔HRP-酶标二抗稀释倍数为1:20000。该方法的检测限IC15为5.12±0.57 ng/mL,IC50为63.94±0.85 ng/mL。以兔多抗作为捕获抗体,鼠多抗作为检测抗体,优化建立了双抗夹心酶联免疫检测方法,捕获抗体包被量为0.05 μg/well,封闭液为0.5%脱脂乳粉,检测抗体稀释倍数为1:2000,羊... 

【文章来源】：天津科技大学天津市

【文章页数】：56 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图３－１澳洲坚果过敏原蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳??Ｆｉｇ．?３－１?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?ｏｆ?ｍａｃａｄａｍｉａ?ｎｕｔ?ａｌｌｅｒｇｅｎ??

Ｍ．?Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｗｅｉｇｈｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｓｔａｎｄａｒｄ；?１－３：?Ｔｈｅ?ｌｏａｄｉｎｇ?ｑｕａｎｔｉｔｙ?ｏｆ?ｍａｃａｄａｍｉａ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｗｅｒｅ７．５??ｆｉｇ、５?ｆｉｇ?ａｎｄ?２．５?卜ｉｇ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ??如图３－２可知，兔多克隆抗体主要特异性识别澳洲坚果中存在的四种蛋白；鼠??多克隆抗体主要特异性识别澳洲坚果中存在的两种蛋白。这两种抗体结合的蛋白条??带存在差异，但澳洲坚果蛋白中存在两种主要蛋白均能被特异性识别。??３．５间接竞争酶联免疫检测方法的建立??３．５．１包被量和检测抗体稀释倍数的优化??澳洲坚果蛋白包被量分别选择〇．丨ｐｇ／孔、０．０５?＾ｉｇ／孔和０．０２５?ｎｇ／孔，兔抗分别以??１：?８０００、１：?１６０００、１：?３２０００的比例进行稀释，通过棋盘法对间接竞争ＥＬＩＳＡ进??行初步优化，根据测定的最大吸光度值计算相应的抑制率，绘制抑制率曲线，最后??通过抑制率曲线公式计算出抑制率为５０％时所对应的蛋〇浓度，即ＩＣ５〇。由表３－４??可知，抗原的包被量与兔多抗稀释倍数对〇＿和１（：５（）的影响很大。选取最大吸光度??值在０．８－１．２左右，且对应的ＩＣ５（）最小的组合作为最优组合。因此，本实验的最佳组??合是包被量为０．０２５?＃／孔

二抗以１：２００００稀释，２５°（：反应３０１１１丨１１。其他操作按照２．２．６．１，最后用酶标仪在??４５０－６５０?ｎｍ读取每孔的对应吸光度值（即ＯＤ值）。以蛋白浓度作为横坐标，吸光??度值作为纵坐标绘制标准曲线。图３－６为双抗夹心ＥＬＩＳＡ检测澳洲坚果过敏原蛋白??的标准曲线，根据定义计算ＬＯＤ值与ＬＯＱ值，得到澳洲坚果的ＬＯＤ值为０．９５?±?０．１７??ｎｇ／ｍＬ，ＬＯＱ?值为?３．１３?±?０．５７?ｎｇ／ｍＬ。??０．９?ｒ??〇８?Ｌ?■?Ｙ＝０．０２３４ｘ－０．０８９２??■?Ｒ２＝０．Ｗ７??０．７?－??ｏ?０．６?－??１０４：?Ｘ??＾?０．３?－?ｉＸ??￣?０．２－??０．１?ｒ??０．０——１——１——１——１——＊——１——？——１——■——１——？——１——１??０?５?１０?１５?２０?２５?３０??澳洲％果过敏原蛋Ｉ＇〗浓度（ｎｇ／ｍＬ）??图３－７澳洲坚果过敏原蛋白双抗夹心酶联免疫检测的标准曲线??Ｆｉｇ．?３－７?Ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ｍａｃａｄａｍｉａ?ｎｕｔ?ａｌｌｅｒｇｅｎｓ?ｏｎ?ｓａｎｄｗｉｃｈ?ＥＬＩＳＡ??通过上述实验可知，双抗夹心ＥＬＩＳＡ方法的检测限（ＬＯＤ）为０．９５?±０．１７?ｎｇ／ｍＬ，??间接竞争ＥＬＩＳＡ方法的检测限为５．１２?±?０．５７?ｎｇ／ｍＬ。与间接竞争酶联免疫检测方法??相比，双体夹心ＥＬＩＳＡ方法灵敏度更高。这是由于在双抗夹心酶联免疫检测方法中，??选用了兔多抗和鼠多抗两种动物制备的抗体，它们都能与澳洲坚果过敏原表面的不??同结合位点发生特异性结合

【参考文献】：
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硕士论文
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本文编号：3040894