载pVAX1/Tat PTD-endostatin壳聚糖纳米基因载体的构建与体外活性评价
发布时间：2021-03-18 10:51
目的构建载内皮抑素（Es）重组表达质粒的壳聚糖纳米基因载体并评价其抑制内皮细胞增殖的活性。方法选用真核表达质粒p VAX1为重组载体,采用PCR及双酶切法制备能够表达Tat PTD-Es融合蛋白的真核表达载体p VAX1/Tat PTD-Es;离子交联法制备壳聚糖载基因纳米粒,琼脂糖凝胶电泳筛选处方,检测纳米粒的形态、Zeta电位及粒径;采用最佳处方比例制备载重组质粒纳米载体,转染人脐静脉内皮细胞HUVEC,采用ELISA法测定分泌型Tat PTD-Es蛋白的表达量,CCK-8法测定对HUVEC的抑制作用,以上两个实验均以LipofectaminTM2000为阳性对照。结果 p VAX1/Tat PTD-Es的真核表达载体构建成功,壳聚糖纳米粒Zeta电位（14.3±1.6）m V,粒径（145±12）nm,纳米粒转染HUVEC后细胞上清中Tat PTD-Es的浓度为（182.5±16.3）ng/m L,壳聚糖基因载体转染HUVEC后对细胞有明显的抑制作用,72 h的抑制率达（53.4±5.4）%（Z=-2.611,P=0.008）。结论构建的壳聚糖纳米基因载体能够成功转染HUVEC并...
【文章来源】：山东大学学报(医学版). 2017,55(07)北大核心
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
阳性重组质粒(pVAX1/TatPTD-Es)的PCＲ验证M:DNAmarkerI(100～600bp);1:阳性对照;2～4:阳性重组质粒;5:阴性对照
ectamineTM2000转染空载体pVAX1的细胞分别作为阴性对照。1．3统计学处理采用SPSS15．0软件，每组试验重复5次，数据以x珋±s表示。在1．2．6中，两组间比较采用Mann-WhitneyU检验。在1．2．7中，CS纳米粒(20μg/mL)分别与CSNPs阴性对照组(转染空载体)及LipofectamineTM2000(20μg/mL)阳性对照比较，均采用Mann-WhitneyU检验。P＜0．05为差异有统计学意义。2结果2．1重组质粒的验证PCＲ反应结果显示，阳性重组质粒扩增出600bp左右条带，见图1。抽提重组质粒后经EcoＲI、KpnI双酶切，琼脂糖凝胶电泳结果见图2，显示3kb和600bp左右两条带。DNA测序表明，重组质粒中的TatPTD-Es序列正确，无突变，且插入方向正确。2．2处方筛选2．2．1CS与DNA的最佳包合比筛选琼脂糖凝胶电泳结果(图3)表明，当CS∶DNA大于或等于20∶1时，DNA可完全滞留在加样孔中，并且随着CS比例增加，有更多的纳米粒滞留在加样孔中。图1阳性重组质粒(pVAX1/TatPTD-Es)的PCＲ验证M:DNAmarkerI(100～600bp);1:阳性对照;2～4:阳性重组质粒;5:阴性对照。Fig．1PCＲresultsofpositiverecombinantplasmid(pVAX1/TatPTD-Es)M:DNAmarkerI;1:Positivecontrol;2-4:Positiverecombinantplasmid;5:Negativegroup．图2重组质粒pVAX1/TatPTDEs的双酶切验证1:重组质粒双酶切产物;M1:1kbDNAmarker(1～10kb);M2:D2000DNAmarker(100～2000bp);2:重组质粒。Fig．2DoubledigestionofpositiverecombinantplasmidpVAX1/TatPTDEsbyrestrictedendonuclease1:DigestionproductsofpositiverecombinantplasmidpVAX1/TatPTDEs;M1:1kbDNAmarker(1-10kb);M2:D2000DNAmarker(100-2000bp);2:PositiverecombinantplasmidpVAX1/TatPTDEs．图3琼脂糖凝胶电泳筛选CS-DNA最佳包合
eyU检验。在1．2．7中，CS纳米粒(20μg/mL)分别与CSNPs阴性对照组(转染空载体)及LipofectamineTM2000(20μg/mL)阳性对照比较，均采用Mann-WhitneyU检验。P＜0．05为差异有统计学意义。2结果2．1重组质粒的验证PCＲ反应结果显示，阳性重组质粒扩增出600bp左右条带，见图1。抽提重组质粒后经EcoＲI、KpnI双酶切，琼脂糖凝胶电泳结果见图2，显示3kb和600bp左右两条带。DNA测序表明，重组质粒中的TatPTD-Es序列正确，无突变，且插入方向正确。2．2处方筛选2．2．1CS与DNA的最佳包合比筛选琼脂糖凝胶电泳结果(图3)表明，当CS∶DNA大于或等于20∶1时，DNA可完全滞留在加样孔中，并且随着CS比例增加，有更多的纳米粒滞留在加样孔中。图1阳性重组质粒(pVAX1/TatPTD-Es)的PCＲ验证M:DNAmarkerI(100～600bp);1:阳性对照;2～4:阳性重组质粒;5:阴性对照。Fig．1PCＲresultsofpositiverecombinantplasmid(pVAX1/TatPTD-Es)M:DNAmarkerI;1:Positivecontrol;2-4:Positiverecombinantplasmid;5:Negativegroup．图2重组质粒pVAX1/TatPTDEs的双酶切验证1:重组质粒双酶切产物;M1:1kbDNAmarker(1～10kb);M2:D2000DNAmarker(100～2000bp);2:重组质粒。Fig．2DoubledigestionofpositiverecombinantplasmidpVAX1/TatPTDEsbyrestrictedendonuclease1:DigestionproductsofpositiverecombinantplasmidpVAX1/TatPTDEs;M1:1kbDNAmarker(1-10kb);M2:D2000DNAmarker(100-2000bp);2:PositiverecombinantplasmidpVAX1/TatPTDEs．图3琼脂糖凝胶电泳筛选CS-DNA最佳包合比Fig．3ScreeningoftheopticalratioofCSandDNAbyagar-osegelelectrophoresis
本文编号：3088198
【文章来源】：山东大学学报(医学版). 2017,55(07)北大核心
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
阳性重组质粒(pVAX1/TatPTD-Es)的PCＲ验证M:DNAmarkerI(100～600bp);1:阳性对照;2～4:阳性重组质粒;5:阴性对照
ectamineTM2000转染空载体pVAX1的细胞分别作为阴性对照。1．3统计学处理采用SPSS15．0软件，每组试验重复5次，数据以x珋±s表示。在1．2．6中，两组间比较采用Mann-WhitneyU检验。在1．2．7中，CS纳米粒(20μg/mL)分别与CSNPs阴性对照组(转染空载体)及LipofectamineTM2000(20μg/mL)阳性对照比较，均采用Mann-WhitneyU检验。P＜0．05为差异有统计学意义。2结果2．1重组质粒的验证PCＲ反应结果显示，阳性重组质粒扩增出600bp左右条带，见图1。抽提重组质粒后经EcoＲI、KpnI双酶切，琼脂糖凝胶电泳结果见图2，显示3kb和600bp左右两条带。DNA测序表明，重组质粒中的TatPTD-Es序列正确，无突变，且插入方向正确。2．2处方筛选2．2．1CS与DNA的最佳包合比筛选琼脂糖凝胶电泳结果(图3)表明，当CS∶DNA大于或等于20∶1时，DNA可完全滞留在加样孔中，并且随着CS比例增加，有更多的纳米粒滞留在加样孔中。图1阳性重组质粒(pVAX1/TatPTD-Es)的PCＲ验证M:DNAmarkerI(100～600bp);1:阳性对照;2～4:阳性重组质粒;5:阴性对照。Fig．1PCＲresultsofpositiverecombinantplasmid(pVAX1/TatPTD-Es)M:DNAmarkerI;1:Positivecontrol;2-4:Positiverecombinantplasmid;5:Negativegroup．图2重组质粒pVAX1/TatPTDEs的双酶切验证1:重组质粒双酶切产物;M1:1kbDNAmarker(1～10kb);M2:D2000DNAmarker(100～2000bp);2:重组质粒。Fig．2DoubledigestionofpositiverecombinantplasmidpVAX1/TatPTDEsbyrestrictedendonuclease1:DigestionproductsofpositiverecombinantplasmidpVAX1/TatPTDEs;M1:1kbDNAmarker(1-10kb);M2:D2000DNAmarker(100-2000bp);2:PositiverecombinantplasmidpVAX1/TatPTDEs．图3琼脂糖凝胶电泳筛选CS-DNA最佳包合
eyU检验。在1．2．7中，CS纳米粒(20μg/mL)分别与CSNPs阴性对照组(转染空载体)及LipofectamineTM2000(20μg/mL)阳性对照比较，均采用Mann-WhitneyU检验。P＜0．05为差异有统计学意义。2结果2．1重组质粒的验证PCＲ反应结果显示，阳性重组质粒扩增出600bp左右条带，见图1。抽提重组质粒后经EcoＲI、KpnI双酶切，琼脂糖凝胶电泳结果见图2，显示3kb和600bp左右两条带。DNA测序表明，重组质粒中的TatPTD-Es序列正确，无突变，且插入方向正确。2．2处方筛选2．2．1CS与DNA的最佳包合比筛选琼脂糖凝胶电泳结果(图3)表明，当CS∶DNA大于或等于20∶1时，DNA可完全滞留在加样孔中，并且随着CS比例增加，有更多的纳米粒滞留在加样孔中。图1阳性重组质粒(pVAX1/TatPTD-Es)的PCＲ验证M:DNAmarkerI(100～600bp);1:阳性对照;2～4:阳性重组质粒;5:阴性对照。Fig．1PCＲresultsofpositiverecombinantplasmid(pVAX1/TatPTD-Es)M:DNAmarkerI;1:Positivecontrol;2-4:Positiverecombinantplasmid;5:Negativegroup．图2重组质粒pVAX1/TatPTDEs的双酶切验证1:重组质粒双酶切产物;M1:1kbDNAmarker(1～10kb);M2:D2000DNAmarker(100～2000bp);2:重组质粒。Fig．2DoubledigestionofpositiverecombinantplasmidpVAX1/TatPTDEsbyrestrictedendonuclease1:DigestionproductsofpositiverecombinantplasmidpVAX1/TatPTDEs;M1:1kbDNAmarker(1-10kb);M2:D2000DNAmarker(100-2000bp);2:PositiverecombinantplasmidpVAX1/TatPTDEs．图3琼脂糖凝胶电泳筛选CS-DNA最佳包合比Fig．3ScreeningoftheopticalratioofCSandDNAbyagar-osegelelectrophoresis
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