一种基于部分双链线性DNA探针的HCV RNA荧光定量RT-PCR检测方法的建立

发布时间：2017-04-23 19:10

  本文关键词：一种基于部分双链线性DNA探针的HCV RNA荧光定量RT-PCR检测方法的建立，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:丙型肝炎病毒(HCV)是全球范围内引起慢性病毒性肝炎的主要病原体之一。据统计,全球约有1.7亿慢性HCV感染者,我国慢性HCV感染者超过1000万。HCV感染后发病隐匿,症状不典型,如果不能及早诊断,容易错过治疗的最佳时机,长期慢性感染可发展为肝纤维化、肝硬化和肝癌等晚期肝病,对人民群众的健康构成严重威胁。HCV RNA是早期诊断HCV的可靠指标,可于感染后1-2周检测到,比抗-HCV抗体出现提前大约1个月。同时,HCV RNA也可作为慢性HCV感染者抗病毒治疗疗效的评价指标。目前,国内外已有多种HCV RNA检测试剂,检测性能各有差异。由于受到经济条件的限制,我国临床实验室以国产HCV RNA试剂占主导,检测性能较进口试剂有明显差异,不能满足临床诊断、治疗的需求。因此,发展一种灵敏度高、稳定性好、价格合理的HCV RNA检测试剂是当前我国HCV研究的主要方向之一。目的:建立一种灵敏度高、稳定性好、特异性强、能够检出所有HCV基因型及亚型的一步法实时荧光定量RT-PCR方法检测HCV RNA。方法:本研究利用体外转录技术制备HCV RNA标准品。在HCV基因组最保守区设计引物、探针,同时设计并优化部分双链线性DNA探针,并与普通单链探针比较。优化HCV RNA检测体系中各组分浓度及反应条件。设置并优化内对照系统。为验证新的实时荧光定量RT-PCR方法的性能,对该方法进行方法学性能评价,包括灵敏度、线性范围、特异性、批内及批间重复性以及与商品化试剂盒同时检测106份血清样品的结果的相关性和一致性。结果:本研究成功制备了HCV RNA标准品。优化了HCV RNA检测体系中各组分浓度及反应条件,比较发现部分双链线性DNA探针优于普通单链探针。通过优化内对照系统,确定每个HCV RNA检测体系中需加入内对照RNA100copies。本研究建立的实时定量RT-PCR方法的线性动态范围为100-1×107IU/ml,检测灵敏度为78 IU/ml。该方法能够检出各种常见HCV基因型、亚型,且针对HCV阴性样品检测结果为100%阴性。该方法具有较好的批内、批间重复性,最大变异系数(CV)分别为1.33%和2.52%。使用新建立的方法与商品化HCV RNA定量检测试剂盒同时检测106份抗-HCV抗体阳性的血清样品,两种方法的检测结果具有很好的相关性(R2=0.940)和一致性,偏差为-0.05log(IU/ml)。结论:本研究建立了一种基于部分双链线性DNA探针的实时定量RT-PCR方法检测HCV RNA。该方法具有高灵敏度、特异性、稳定性,能够检出各种常见HCV基因型、亚型,能够实现对血清样本中HCV RNA准确定量检测。适用于HCV感染的筛查、诊断,以及慢性HCV感染者抗病毒治疗的疗效监测。
【关键词】：丙型肝炎病毒 HCV RNA检测 实时定量RT-PCR
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R440
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 前言9-12
• 材料与方法12-24
• 1 实验材料12-14
• 1.1 主要试剂12
• 1.2 主要仪器及耗材12-13
• 1.3 临床样品13
• 1.4 研究相关材料的制备13-14
• 2 实验方法14-24
• 2.1 HCV RNA标准品的制备14-19
• 2.2 HCV RNA检测体系中引物、探针的设计与合成19-20
• 2.3 HCV RNA 检测体系中内对照系统的建立20
• 2.4 HCV RNA的提取及纯化20-21
• 2.5 HCV RNA检测体系的优化21-22
• 2.6 HCV RNA 检测体系中两种探针的比较22
• 2.7 HCV RNA检测体系的方法学性能评价22-24
• 结果24-34
• 3.1 HCV RNA标准品的制备24-26
• 3.2 HCV RNA检测体系中涉及的寡核苷酸链序列26
• 3.3 HCV RNA检测体系的优化26-28
• 3.4 HCV RNA检测体系中两种探针的比较28
• 3.5 HCV RNA检测体系中内对照RNA浓度的优化28-29
• 3.6 HCV RNA检测体系的方法学性能评价29-34
• 3.6.1 灵敏度29
• 3.6.2 线性范围29-30
• 3.6.3 特异性30-31
• 3.6.4 批内、批间重复性31-32
• 3.6.5 一致性32-34
• 讨论34-37
• 结论37-38
• 参考文献38-41
• 综述41-52
• 参考文献49-52
• 缩略词表52-53
• 在学期间的研究成果53-54
• 致谢54

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