尿液exosome分离方法研究

发布时间：2017-04-28 15:00

  本文关键词：尿液exosome分离方法研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的比较3种方法即超速离心法、超滤法和沉淀法对人尿液来源exosome分离结果的影响,并进一步探究exosome的最佳分离条件。本研究为临床上选择合适的人尿液exosome分离方法提供了参考依据。方法1.采用超速离心法、超滤法及沉淀法分别从20个健康人和10个慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)患者尿液中分离提取exosome;用透射电镜(transmission electron microscope,TEM)观察exosome大小形状,蛋白质印迹法(Western-blot)检测exosome标志蛋白TSG101及Alix以鉴定exosome。2.在尿量及exosome总蛋白量相同情况下,用Western-blot检测3种方法分离提取的尿exosome中标志蛋白,比较不同分离方法分离尿exosome的效果。3.Western-blot检测尿exosome中标志蛋白以分析尿液样本17,000g离心前是否有必要低速离心去除细胞以及不同离心力(100,000g,150,000g,200,000g及250,000g)、离心时间(0.5h,1h及2h)及温度(4℃,25℃及37℃)对超速离心分离尿液exosome结果的影响。结果1.在透射电镜下,3种方法分离的exosome都呈圆形或椭圆形囊泡样结构,直径40-100nm、包膜完整,腔内为均一的低电子密度物质。Western-blot法检测exsome标志蛋白TSG101和Alix,结果显示,超速离心法及超滤法可以检测到exosome标志物TSG101、Alix,而超速离心法上清、超滤法滤液、沉淀法沉淀和上清都未能检测到。2.在尿量相同情况下,3种分离方法获得exosome分别进行蛋白标志物TSG101及Alix检测,Western-blot结果显示超速离心法印迹条带灰度最深,且所有样本均能检测出TSG101及Alix蛋白;超滤法获取的exosome,健康人尿液来源的exosome均能检测出TSG101及Alix蛋白,但在CKD患者均未能检测到;而沉淀法在所有样本均未检测到exosome标志蛋白。调整上样体积使得exosome总蛋白量Western-blot检测3种分离方法得到的exosome中的标志蛋白,结果显示超速离心法分离得到的exosome量最多且在所有样本均能检测到TSG101及Alix蛋白表达;超滤法在20个健康人中有11个人能检测到TSG101及Alix,10个CKD患者未能检测到;而沉淀法在所有样本均未检测到exosome志蛋白。3.Western-blot结果表明,低速离心去除细胞的尿样本及未低速离心去除细胞的尿样本,分离获得的exosome印迹条带灰度无明显差异;超速离心法分离尿液exosome,随着离心力及离心时间的增加,印迹条带灰度逐渐加深,250,000g,2h离心条件下分离获得的exosome印迹条带灰度最深,而不同温度条件下,印迹条带灰度无明显差异。结论较超滤法及沉淀法,超速离心法分离尿液exosome的效率最高,是值得推荐的尿液exosome分离方法。尿液样本17,000g离心前无需低速离心去细胞,超速离心法分离尿液exosome效果在离心力为250,000g及离心时间为2h时分离效果最好,而离心温度对exosome分离无明显影响。
【关键词】：超速离心法 超滤法 沉淀法 尿 exosome分离
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R446.12
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-15
• 注释表15-17
• 第一章 绪论17-23
• 1.1 exosome17-18
• 1.1.1 exosome概述17
• 1.1.2 exosome的生理病理学功能17-18
• 1.1.3 exosome的临床应用18
• 1.2 尿液来源exosome18-22
• 1.2.1 尿液exosome概述18-19
• 1.2.2 尿样本收集、存储及分离前处理19-20
• 1.2.3 尿液exosome分离纯化20-22
• 1.3 小结22-23
• 第二章 研究目的、方法、实验设计方案和意义23-25
• 2.1 研究目的23
• 2.2 研究方法23-24
• 2.3 实验设计方案24
• 2.4 研究意义24-25
• 第三章 尿液exosome分离鉴定25-31
• 3.1 材料与仪器25-26
• 3.1.1 主要材料25
• 3.1.2 主要仪器25-26
• 3.2 方法26-27
• 3.2.1 人尿液样本收集及前处理26
• 3.2.2 尿液exosome的分离26-27
• 3.2.3 透射电镜观察尿液exosome的形态27
• 3.2.4 BCA法检测尿液exosome总蛋白浓度27
• 3.2.5 Western-blot检测尿液exosome的标志蛋白27
• 3.3 结果27-29
• 3.3.1 尿液exosome的形态特征27-28
• 3.3.2 尿液exosome总蛋白浓度检测28
• 3.3.3 尿液exosome标志蛋白检测28-29
• 3.4 讨论29-31
• 第四章 尿液exosome 3 种分离方法比较31-40
• 4.1 材料与仪器31-32
• 4.1.1 主要材料31-32
• 4.1.2 主要仪器32
• 4.2 方法32-34
• 4.2.1 人尿液样本收集及前处理32
• 4.2.2 超速离心法分离尿液exosome32-33
• 4.2.3 超滤法分离尿液exosome33
• 4.2.4 沉淀法分离尿液exosome33
• 4.2.5 BCA法检测尿液exosome总蛋白浓度33
• 4.2.6 尿量或exosome总蛋白量相同情况下Western-blot检测尿液exosome的标志蛋白33-34
• 4.3 结果34-38
• 4.3.1 相同体积尿样本条件下3种不同分离方法的比较34-36
• 4.3.2 相同exosome总蛋白量条件下3种不同分离方法的比较36-38
• 4.4 讨论38-40
• 第五章 超速离心法分离尿液exosome方法优化40-49
• 5.1 材料与仪器40-41
• 5.1.1 主要材料40
• 5.1.2 主要仪器40-41
• 5.2 方法41-42
• 5.2.1 人尿液样本收集及前处理41
• 5.2.2 超速离心法分离尿液exosome41-42
• 5.2.3 Western-blot检测尿液exosome的标志蛋白42
• 5.3 结果42-48
• 5.3.1 低速离心去细胞对尿液exosome分离的影响42-44
• 5.3.2 超速离心法分离尿液exosome的适宜条件探究44-48
• 5.4 讨论48-49
• 第六章 结论与展望49-50
• 一、结论49
• 二、展望49-50
• 参考文献50-55
• 尿液exosome的分离方法及在临床中应用研究进展(综述)55-67
• 参考文献63-67
• 致谢67-68
• 攻读硕士学位 期间发表的学术论文68

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